山 花，贺亚南，冯元州，何嘉玲，朝 宝，刘彩萍，王永安，董 武，张东威，赵宝全
（1.内蒙古民族大学临床医学院，内蒙古 通辽 028000；
2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850；
3.国家卫生健康委科学技术研究所，北京 100081）
近年来，模式生物斑马鱼（zebra fish）因其胚胎和幼鱼透明、与人类基因高度保守及适合高通量毒物药物筛选等优势，在发育生物学、毒理学和药理学研究中得到了广泛应用［1-6］。在进行毒理学和药理学实验时，经常遇到有些化合物溶解度较低或不溶解，需用二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作为助溶剂。DMSO是一种常用的既溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂，对机体具有很强的渗透能力，又因其本身具有消炎止痛、利尿和镇静等作用，在医药工业中可直接用作某些药物的原料及载体［7-9］。1961年，DMSO首次作为药物制剂用做器官保护剂，后来发现DMSO对多种哺乳动物的晶状体产生影响而被停止使用，自那时起DMSO便被认为是有毒物质。作为助溶剂配制试剂，不同浓度DMSO对模式生物的影响不同，DMSO本身对生物体具有毒性作用，若使用不当，可能会造成假阳性实验结果。斑马鱼对某些药物非常敏感，现有相关斑马鱼胚胎发育的致死、孵化及畸形效应的研究表明，DMSO浓度≥0.6%时，斑马鱼胚胎在受精后48，72和96 h孵化率显著下降，死亡率增加并产生大量畸形［10］。DMSO对心血管和神经系统也具有一定的毒性作用，脊椎动物心脏的正常发育和功能对胚胎和出生后个体的行为活动至关重要。人类的许多先天性心脏缺陷均与心房静脉和心肌起搏细胞形成或维持的基因断裂有关［11］。肌球蛋白是一种高度保守、普遍存在于所有真核细胞中的蛋白质，它为细胞分裂、吞噬和肌肉收缩等多种运动提供运动功能［12］。和所有脊椎动物一样，斑马鱼的心脏是胚胎发育过程中第一个形成并发挥作用的器官。斑马鱼心脏发育的初始阶段包括心肌细胞祖细胞的分化、迁移和分化。因为保存了早期心脏发育的分子机制，斑马鱼已成为研究脊椎动物心脏形成早期过程的一个很好工具［13-19］。斑马鱼幼鱼运动行为测定方便快捷，能直观反映幼鱼的行为状态和发育状态，在毒理学和药理学研究中被广泛应用［23］。本实验室利用DMSO作为助溶剂进行斑马鱼相关实验时发现，其浓度≥0.30%时斑马鱼心率和运动行为与正常对照组相比均出现显著性差异，这与现有文献推荐的DMSO对斑马鱼胚胎的安全浓度≤0.5%存在差异。为避免在斑马鱼实验助溶剂DMSO对实验结果的干扰，有必要对安全性进行系统再评估。
1.1 试剂和仪器
DMSO（美国ACROS公司）；
50×E3培养液（NaCl 2.925 g，MgSO40.396 g，CaCl20.3663 g，KCl 0.1267 g，定容至1.0 L）、总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和2X S6 SYBR Premix EsTaq plus（with Tli RNaseH）（北京赛音图科技有限公司）。
斑马鱼循环水养殖系统（北京爱生科技公司）；
光学显微镜（日本尼康公司）；
生化培养箱（一恒科学仪器有限公司）；
斑马鱼行为学检测系统（荷兰Noldus公司）；
LightCycler®96定量PCR仪（瑞士Roche公司）。
1.2 实验动物
野生型AB系斑马鱼为北京大学生命科学学院提供，由毒物药物研究所斑马鱼养殖系统繁育。水温约28.5℃，pH 6.5～7.5，电导率450～550 μs·cm-1，在黑暗与光照周期为10 h/14 h的条件下养殖，成年斑马鱼每日喂食丰年虾幼虫，早晚各1次。在暗周期开始前，将雌雄斑马鱼按1∶2比例放入专用交配鱼缸中备用，加入循环养殖水并加隔板分开雌雄鱼，用黑布遮盖。隔天早上8∶00将黑布掀开给予光照，抽离隔板。在光刺激下雄鱼追逐雌鱼交尾，产卵15 min后收集受精卵。将鱼卵置培养皿中，用养殖水轻柔冲洗掉未受精卵及粪便等杂物，清洗数次，置入生化培养箱中孵育。
1.3 斑马鱼胚胎分组和处理
将受精后4 h的斑马鱼胚胎在显微镜下观察，挑选出发育正常且处于囊胚期的胚胎。分为正常对照组及用E3孵化液稀释的含DMSO终浓度（V/V）0.15%，0.30%，0.45%和0.60%组。每组25枚发育正常的胚胎，置6孔细胞培养板中，吸去多余液体。正常对照组加不含DMSO的E3孵化液，DMSO各浓度组分别加入上述所配各浓度溶液4 mL，置（约28.5℃）恒温培养箱中培养，连续暴露6 d。实验过程中每24 h更换1次受试溶液，以保证溶液中各参数的稳定。取来自不同亲本的胚胎暴露处理，重复实验3次。
1.4 记录斑马鱼胚胎和幼鱼心率
取1.3分组处理的斑马鱼胚胎，利用Noldus斑马鱼行为学分析系统分别记录持续暴露于DMSO 2，3（胚胎和幼鱼）和4 d（幼鱼）后斑马鱼胚胎和幼鱼的心率。
1.5 行为学实验
将暴露4和6 d的DMSO组和正常对照组幼鱼分别置96孔板中，每组各8条，每孔1条。将96孔板置Noldus斑马鱼行为学分析系统的暗箱中，使用Noldus行为学软件采集3 min内幼鱼的运动轨迹，利用Etho Vision XT10软件导出总游动距离和游动时间，计算幼鱼游动速度和游动频次，实验重复3次。
1.6 实时荧光定量PCR检测胚胎和幼鱼心脏发育和运动相关基因mRNA表达水平
取1.3分组处理的斑马鱼胚胎至1.5 mL离心管中，分别暴露2，4和6 d，尽量吸净溶液。根据赛音图试剂盒说明提取总RNA，并逆转录成cDNA。cDNA稀释后进行实时荧光定量PCR，检测心房特异性肌球蛋白重链（atrium-specific myosin heavy chain，amhc）和心室特异性肌球蛋白重链（ventriclespecific myosin heavy chain，vmhc）基因表达变化，以及运动相关基因γ-氨基丁酸转氨酶（4-aminobutyrate aminotransferase，abat），γ-氨基丁酸A型受体亚基α1（gamma-aminobutyric acid type A receptor subunit alpha1，gabra1）和谷氨酸脱羧酶1b（glutamate decarboxylase 1b，gad1b）表达变化。PCR引物（表1）由上海生工合成。RT-PCR反应体系为20 μL，反应条件：95℃ 30 s；
95℃ 5 s，60℃ 30 s，并在此步结束时收集荧光，45个循环；
95℃ 5s，60℃ 1 min，95℃ 1 s；
37℃ 30 s。采用2-△△Ct定量目的基因mRNA相对表达水平。
Tab.1 Primer sequences for RT-PCR
1.7 统计学分析
实验结果数据用±s表示，采用GraphPad Prism 9软件分析。组间差异采用One-way ANOVA分析，两两比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.1 DMSO暴露对斑马鱼胚胎和幼鱼心率的影响
与正常对照组相比，DMSO暴露2 d，心率变化无显著性差异（图1）；
暴露3 d后，随着DMSO浓度升高，心率逐渐降低，0.45%和0.60%组显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；
暴露4 d，0.30%，0.45%和0.60%DMSO组心率显著降低（P＜0.05，P＜0.01），分别为165.1±1.2，158.8±4.4和（152.9±2.9）min-1。
Fig.1 Effect of dimethyl sulfoxide（DMSO）on heart rate of zebrafish embryos and juveniles.Zebrafish 4 h post-fertilization（4 hpf）were exposed to DMSO at percentage concentrations of 0.00%（normal control），0.15%，0.30%，0.45% and 0.60% for 2 d（embryos），3 d and 4 d（juveniles）.±s，n=4.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding normal control group.
2.2 DMSO暴露对斑马鱼幼鱼运动行为的影响
DMSO暴露6 d，正常对照组斑马鱼幼鱼游动活跃，游动距离较长；
与正常对照组相比，0.45%和0.60%DMSO组游动时间和游动速度明显缩短（图2A～C）；
0.15%DMSO组游动频次和游动距离无显著差异，0.30%，0.45%和0.60%DMSO组显著降低（P＜0.05，P＜0.01图2D）。
Fig.2 Effect of DMSO on behavior of zebrafish juveniles.See Fig.1 for the exposed concentrations.4 hpf zebrafish embryos exposed to DMSO for 6 d.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.
2.3 DMSO对斑马鱼胚胎和幼鱼心脏发育相关基因amhc和vmhc mRNA表达的影响
与正常对照组相比，DMSO暴露2 d各浓度DMSO组，胚胎amhcmRNA表达水平无显著性差异，但仅0.60%DMSO组vmhcmRNA表达显著下调（P＜0.05）（图3A）。暴露4 d，各浓度DMSO组斑马鱼幼鱼amhc和vmhcmRNA表达显著下调（P＜0.01）（图3B）；
暴露6 d，0.30%DMSO组amhcmRNA表达上调（P＜0.05），0.15%，0.45%和0.60%DMSO组amhc和vmhcmRNA表达均显著上调（P＜0.01）（图3C）。
Fig.3 Effect of DMSO exposeure on mRNA expressions of amhc and vmhc in zebrafish embryos and juveniles.See Fig.1 for the exposed concentrations.4 hpf zebrafish embryos were exposed to DMSO for 2（A），4（B）and 6 d（C）.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.
2.4 DMSO对斑马鱼胚胎和幼鱼运动相关基因gad1b，gabra1和abat mRNA表达的影响
与正常对照组相比，DMSO暴露2 d，DMSO各浓度组gad1bmRNA表达显著下调（P＜0.01，图4A），0.45%DMSO组gabra1mRNA表达显著下调（P＜0.05），0.15%DMSO组abatmRNA表达显著上调（P＜0.01），而 0.45% 和 0.60%DMSO 组abatmRNA表达显著下降（P＜0.01）。暴露4 d，DMSO各浓度组gad1b，gabra1和abatmRNA表达显著下调（P＜0.01）（图4B）。暴露 6 d，gad1bmRNA表达均显著下调（P＜0.01）（图4C），0.60%DMSO组gabra1mRNA表达显著上调（P＜0.01），0.15，0.45和0.60%DMSO组abatmRNA表达显著上调（P＜0.01，图4C）。
Fig.4 Effect of DMSO exposure on mRNA expressions of gad1b，gabra1 and abat in zebrafish embryos and juveniles.See Fig.1 for the exposed concentrations.4 hpf zebrafish embryos were exposed to DMSO for 2（A），4（B）and 6 d（C）.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.
本研究结果显示，DMSO浓度≥0.30%时，斑马鱼幼鱼心率下降较明显，随着暴露剂量的增加和暴露时间的延长，幼鱼的心率逐渐降低。amhc对心房功能至关重要，是收缩器的腔室特异性成分，构成了胚胎心房的独特功能属性，也决定心房形状、大小以及组织结构［16］。只在心房中表达的amhc表达变化直接影响心房的收缩［20］。本研究结果显示，暴露4 d时，DMSO各浓度组幼鱼amhcmRNA表达显著下降，暴露6 d时，幼鱼amhcmRNA表达升高显著。DMSO对幼鱼amhcmRNA的表达的影响会进一步影响心房发育，并对心房产生毒性。
心房功能的丧失会影响胚胎的心室形态［21］。vmhc基因最初表达于斑马鱼前外侧中胚层，之后其表达局限于心室［22］。本研究结果显示，DMSO暴露2 d时，0.60%DMSO组vmhcmRNA表达下降显著；
暴露4 d时，DMSO各浓度组vmhcmRNA表达显著下调；
暴露6 d时，DMSO各浓度组vmhcmRNA显著上调。表明DMSO对amhcmRNA表达的影响大于对vmhcmRNA表达的影响，提示DMSO对心房的影响可能大于对心室的影响，其具体的调控机制要进一步研究。
本研究发现，DMSO暴露6 d时，随着DMSO浓度的增高，幼鱼的游动速度和游动距离逐渐减小，0.45%和0.60%DMSO对斑马鱼幼鱼的运动行为有明显抑制作用。暴露2，4和6 d，gad1bmRNA表达下调，且随DMSO浓度升高而逐渐降低，与斑马鱼幼鱼的运动行为减弱相一致。暴露2 d时，DMSO各浓度组gabra1mRNA表达均下调，且随DMSO浓度的升高而降低。暴露4 d时，DMSO各浓度组gabra1mRNA表达均显著下调。而暴露6 d时，DMSO各浓度组gabra1mRNA表达略有上调，只有0.60%组上调具有统计学意义。配体通过受体起作用，神经相关受体的表达直接影响到神经行为，gabra1受体被激活后，可选择性地让Cl-通过，引起神经元超极化，这种超极化引起了神经信号传递抑制，可能与运动行为下降有关。暴露2 d时，0.15%DMSO组abatmRNA表达上调，其他各组均下调，0.45%和0.60%组abatmRNA表达均下调。暴露4 d时，各组abatmRNA表达均显著下调。暴露6 d时，各组abatmRNA表达均上调。abatmRNA上调应使γ-氨基丁酸含量下降，从而使运动行为增强，但本实验中0.60%DMSO组表达上调，表现的却是运动行为减弱，其原因还需进一步研究。
综合上述各基因的表达情况表明，斑马鱼的运动行为受DMSO影响，且随着浓度升高，运动能力下降，与γ-氨基丁酸受体系统上下游各基因的表达密切相关，其基因相互作用的调控关系需进一步研究。同时提出DMSO在斑马鱼实验中，作为助溶剂，应该考虑到对心脏和神经的毒性，在保证溶质溶解的前提下，DMSO的浓度应低于0.30%，并要做好相应的实验对照。
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