叶建新，陈星宇，张成宇，赵 双，李昭龙，王冠男，程晓薇，于忠娜，于 雷
(青岛农业大学海都学院，山东莱阳 265200)
奶牛乳房炎是危害全世界奶牛的主要疾病之一[1]，也是影响奶牛健康和乳制品安全的关键因素[2]。乳房内细菌性感染被认为是奶牛乳房炎的主要原因。其中，金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要传染性病原体之一[3]，也是一种常见的食源性致病微生物。奶牛感染金黄色葡萄球菌引发的乳房炎通常是慢性感染[4]，虽然不会导致奶牛的异常或死亡，但由该菌产生的降解酶和毒素会不可逆地损害乳房组织[5]，最终降低产奶量。目前，应用抗生素仍是奶牛乳房炎的主要治疗策略[6]。但使用抗生素治疗由金黄色葡萄球菌引发的感染，会使该菌产生生物膜并适应宿主环境[7-8]，产生耐药性[9]，从而增加治疗难度。此外抗生素会在奶牛体内产生不同程度的药物残留，这不仅制约了我国畜牧业的健康发展，也将危害人们的日常饮食健康[10]。
我国中草药资源丰富，且中草药具有毒副作用小、药物残留少等优点，且中草药的活性物质具有抗菌、消炎和免疫调节等作用。使用中草药代替抗生素在如今的无抗时代是大势所趋，可以从根本上提高牛奶品质，提高畜牧业的经济效益[11]。试验选取并研究了22味中草药及其复方对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果，为进一步研发防治金黄色葡萄球菌引起的乳房炎中草药制剂及实际临床应用提供参考资料。
1.1 试验菌株 金黄色葡萄球菌，分离自山东省烟台市某奶牛场患乳房炎奶样，由青岛农业大学食品科学与工程学院微生物实验室鉴定、保存并赠送。
1.2 试验药物 黄芩、钩藤、王不留行、菊花、神曲、红花、白头翁、金银花、独活、大黄、山药、桃仁、黄柏、丹皮、藿香、甘草、柴胡、白术、黄芪、蒲公英、地榆、厚朴共22味中药，均购自于山东省莱阳市枣行药店。
1.3 试剂和仪器 LB培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；
恒温培养箱(WJ-3-160),购自上海跃进医疗器械厂；
超净工作台(SW-CJ-2FD),购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；
恒温摇床(SHAKE SCS-24)，购自上海市离心机械研究所有限公司；
常规仪器与试剂,均由青岛农业大学海都学院预防兽医学实验室提供。
1.4 菌液活化及浓度的测定 金黄色葡萄球菌的分离活化，参考文献[12]的方法进行，将冷冻保存的菌种划线接种至平板培养基，37 ℃培养24 h；
挑取单个菌落接种至5 mL液体培养基，37 ℃、200 r·min-1摇床培养16 h。每隔2 h用分光光度计在600 nm测定OD值，确定细菌的对数期，参考文献[13]的方法，利用平板计数法测定菌落数，调整菌液的浓度为2x109CFU·mL-1。
1.5 中药的制备 称取各中药20 g置于烧杯中加入300 mL蒸馏水，浸泡1 h后，倒入锅中武火加热至沸腾，随后文火加热50 min。加热后用8层纱布过滤，取出药渣，再加入300 mL蒸馏水，倒入锅中，步骤同上。合并两次滤液，加热浓缩至1 g·mL-1，室温放置12 h，6 000 r·min-1离心5 min，取上清液，高压灭菌，在4 ℃冰箱中保存。
1.6 药敏片的处理 参考文献[14]的方法，取22味中药提取液各1 mL于1.5 mL离心管中，分别放入10片药敏片，充分浸泡24 h后，转移至玻璃平皿中并将药敏片不重叠的摆平分开。放入37 ℃恒温箱烘干24 h后做好标记，放入4 ℃冰箱备用。
1.7 中药抑菌试验及复方的抑菌试验
1.7.1 单味中药的抑菌试验 取20 μL稀释后的菌液(2x108CFU·mL-1)于培养皿中，用涂布棒均匀涂布，用镊子在酒精灯火焰上消毒后，夹取处理过的药敏片放入培养皿中，按平按实，并在平板底部做好标记。用封口膜对培养皿进行封口处理，倒置平板，放入恒温箱37 ℃培养24 h。每种药物3个重复，取平均值。参照文献[15]的测定标准：抑菌圈大于15 mm时判定为高敏，介于10～15 mm时判定为中敏；
小于10 mm时判定为低敏。
1.7.2 中药复方的筛选及抑菌试验 把地榆、黄芩、白术、丹皮提取液按2∶2∶2∶1、4∶4∶4∶1、2∶2∶1∶2、4∶4∶1∶4、2∶1∶2∶2、4∶1∶4∶4、1∶2∶2∶2、1∶4∶4∶4的比例配伍，制备复方中药的水提液，并依次命名为复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ，各复方药物浓度均为1 g·mL-1，6000 r·min-1离心5 min，过滤后高压灭菌，置于4 ℃保存。中药复方的药敏片处理与1.5相同；
复方中药的抑菌试验与1.6.1相同。
1.7.3 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定 参照文献[16]在1～7号管和9号管各加入0.1 mL稀释好的菌液(2x108CFU·mL-1)，37 ℃恒温培养24 h，具体步骤见表1，24 h后将制备好的菌液涂布于培养基上，置于37 ℃恒温箱18 h，以菌落分散生长的视为有抑菌效果，此时最低药物浓度值为其MIC值;以肉眼观察无菌落生长的为100 %被杀灭，此时最低药物浓度值为MBC。
表1 二倍稀释法Tab 1 Double dilution method
2.1 单味中药抑菌试验结果 由表2可见，22味中药中筛选出对奶牛乳房炎致病菌金黄色葡萄球菌有抑菌作用的有13种，其中黄芩和地榆的抑菌效果最佳，抑菌圈直径分别为18.30±1.02 mm和18.32±1.00 mm，均属于高度敏感；
黄柏、丹皮、甘草、白术、独活共5味中药均属中度敏感，抑菌圈直径分别为11.88±0.36 mm、13.34±0.56 mm、10.60±0.26 mm、14.48±0.66 mm和11.30±0.58 mm；
藿香、柴胡、黄芪、蒲公英、菊花、金银花共6味中药属低度敏感；
其余9种无抑菌效果。
表2 单味中药抑菌结果(mm)Tab 2 Antibacterial test results of single traditional Chinese medicine(mm)
2.2 复方中药抑菌试验结果 由表3可见，所有复方对奶牛乳房炎致病菌金黄色葡萄球菌均表现出一定的抑菌效果，且均为高度敏感。
表3 复方中药抑菌试验结果(mm)Tab 3 Antibacterial test results of compound traditional Chinese medicine(mm)
2.3 单味中药MIC和MBC测定结果 22味中药中，地榆的MIC值为31.25 mg·mL-1，MBC值为31.25 mg·mL-1，抑菌和杀菌效果较其他单味中药强，其次是黄芩和白术。具体数据见表4。
表4 单味中药MIC和MBC测定结果(mg·mL-1)Tab 4 Determination results of MIC and MBC of single traditional Chinese medicine(mg·mL-1)
2.4 中药复方MIC和MBC测定结果 八种中药复方制剂中复方Ⅱ和复方Ⅶ的抗菌和杀菌能力较强，其MIC和MBC均为31.25 mg·mL-1；
其余中药复方也有一定抑菌效果。具体数据见表6。
表5 中药复方MIC和MBC测定结果(mg·mL-1)Tab 5 Determination results of MIC and MBC of traditional Chinese medicine compound(mg·mL-1)
研究发现单味中药中黄芩和地榆水提液对金黄色葡萄球菌体外抑菌呈高度敏感，左国营等人[17]的结果也显示地榆、黄芩两种药物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果。研究证实，黄芩的主要抑菌成分是黄芩苷和黄芩素，其中黄芩素能够抑制细菌形成生物保护膜，削弱细菌的自我保护能力，并通过干扰细菌蛋白质合成和抑制三羧酸循环达到抑菌作用，黄芩不仅作为单味药发挥抑菌作用明显，与其它中药配伍时还能起到良好的协同作用[18]。鞣质、酚酸类、皂苷类及黄酮类成分是地榆发挥其抑菌效果的主要活性成分[19]。地榆可能是通过提高金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性，破坏细菌整体的稳定性和完整性，利于鞣质等抑菌成分进入细菌内部，从而发挥抑菌作用。本试验中白术、丹皮对金黄色葡萄球菌也具有较好的抑菌效果，这与前人[20-21]的研究结果一致。白术主要是通过挥发性油和多糖类成分进行抑菌，白术挥发油对鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和草绿色链球菌的抑菌作用明显[22]。本试验采用水煎法熬制中药，无法获得白术挥发油，证实白术水提液对金黄色葡萄球菌也具有较好的抑菌作用，但其抑菌机制有待进一步研究。
试验采用二煎法水煎的方式熬制提取中药，但是各类中药性状、结构不同，仅用传统水煎方法提取出的中药有效成分有所差异，水溶性成分并不是所有中药的有效抑菌成分，采取水煎法所提取的药液并不能完全发挥出所选取中药的真正抑菌效果，可能得到的水提药液中仅是一般化学成分，或是活性成分的前体成分，其对试验结果存在不同程度的影响。本试验中所得的中药抑菌圈直径与相关文献[23-25]有一定差异，可能是菌株的来源不同、中药的提取方法不同、抑菌试验采用的方法不同而造成结果上的差异。此外，本研究中单味中草药对金黄色葡萄球菌抑菌效果测定结果多为低敏或不敏感，可能是单味中药药敏试验中所选的浓度过低所致，还需要调整药液浓度进一步研究，筛选出对病原菌有抑菌效果的药液浓度。
研究发现复方药的抑菌效果普遍强于单味药，可能是所选中药之间发挥协同抑菌作用；
但复方药中也存在抑菌效果弱于单味药，可能是复方药中仅单味中药发挥抑菌作用或某几种中药出现拮抗抑菌作用。各类中药对金黄色葡萄球菌的抑菌机制各不相同，从而产生的抑菌效果也存在差异。因此挑选合适的，具有高效抑菌的中药具有非常重要的临床价值。而通过组合、配伍将不同的单味药形成副作用小、抑菌效果好的复方中药仍然需要不懈的深入研究，在当今国家严格管控抗生素使用的背景下，本试验为临床上研究防治奶牛乳房炎致病菌中金黄色葡萄球菌的中药复方提供参考。由于中药种类较多，有效成分复杂，其复方的配比和复方之间抑菌作用的相互影响还有待进一步研究。