姜 菲 赖 琦* 高彦华** 彭忠利 董利锋 张佳雯 李 潇 廖宇鹏
(1.西南民族大学畜牧兽医学院，青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，动物科学国家民委重点实验室，成都610041；
2.中国农业科学院饲料研究所，北京100081；
3.四川爱客信生物科技股份有限公司，广汉628300)
异位酸又称为支链挥发性脂肪酸(branched chain volatile fatty acids，BCVFA)，是含4～5个碳原子的短链挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)，包括戊酸、异丁酸和2-甲基丁酸等，是反刍动物常用的饲料添加剂[1-2]。动物试验和体外发酵试验均表明，反刍动物饲粮中添加2-甲基丁酸、异丁酸或异戊酸能显著提高纤维分解菌数量和纤维素酶活性[3-5]。此外，异位酸还能提高纤维的降解率。Roman-Garcia等[6]研究发现，饲粮中添加各2 mmol/L的异丁酸、异戊酸和2-甲基丁酸混合物能够提高底物中性洗涤纤维(NDF)的体外降解率；
Wang等[7]研究发现，饲粮中添加2-甲基丁酸能显著增加肉牛玉米青贮NDF的瘤胃降解率，提高粗饲料的利用率。在改善纤维消化率的同时，异位酸通过给瘤胃微生物提供碳骨架，使瘤胃微生物能够转化非蛋白氮(NPN)生成更多的微生物蛋白(MCP)[8]。因此，反刍动物饲粮中添加适宜水平的异位酸有利于改善瘤胃发酵性能，提高粗纤维消化率，但其作用效果与异位酸种类以及饲粮类型有关。
异位酸主要来源于蛋白质降解后的氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)经氧化脱氨基和脱羧基后的产物[9]，反刍动物在常规饲养条件下产生的异位酸，与乙酸、丙酸、丁酸相比是很微量的，因此成为限制瘤胃微生物发酵和养分代谢的重要因子[10]。川西高原牦牛常年以牧草作为其主要的粗饲料来源，且多数牧草中蛋白质含量较低，此饲养条件下可能会产生瘤胃异位酸生成不足的问题，进而造成瘤胃微生物生长代谢受限，影响牦牛的生长性能。目前，关于异位酸的种类及添加水平对反刍动物瘤胃体外发酵的影响主要集中在奶牛、犊牛、肉牛和羊的研究上，而关于高原牦牛的研究较少。箭筈豌豆(Viciasativa)和燕麦(Avenasativa)是川西高原牦牛采食的常见牧草，但是不同地域和不同季节的箭筈豌豆和燕麦养分存在差异。为了更好地指导四川省甘孜县牦牛对牧草的利用，本研究首先采用康乃尔净碳水化合物-蛋白质体系(CNCPS)评价箭筈豌豆和燕麦的营养价值；
并结合高原牧草实际使用情况，在底物筛选的步骤中将箭筈豌豆和燕麦进行一定比例组合，起到平衡养分、提高2种牧草消化率的作用，从而更好地利用2种牧草；
在此基础上再筛选适宜的异位酸种类及添加水平，最终达到提高粗饲料消化率、缩短牦牛生长周期、降低养殖成本的生产目的。
1.1 试验设计
试验由3部分组成，分别是利用CNCPS评定箭筈豌豆和燕麦草营养价值试验、不同箭筈豌豆与燕麦组合的体外发酵试验以及添加异位酸对牦牛瘤胃体外发酵产气量、 发酵参数和养分降解率的影响试验。
1.1.1 CNCPS评定箭筈豌豆和燕麦草营养价值试验
将样品先于(103±2) ℃下烘15 min，然后立即降到65 ℃烘干5～6 h，取出于室内空气中冷却4 h，粉碎过40目筛后制备成风干样品保存，用于后续常规养分的测定。
1.1.2 不同箭筈豌豆与燕麦组合的体外发酵试验
将箭筈豌豆与燕麦按照5种不同比例组合，体外发酵箭筈豌豆与燕麦的底物组合见表1。试验共5个组合，每个组合4个重复，进行72 h的体外发酵试验，筛选箭筈豌豆和燕麦作为发酵底物的最佳组合比例。
瘤胃液的采集：2021年1月5日于成都青白江屠宰场选取体况较好的麦洼公牦牛，屠宰后立即采集瘤胃液，用4层纱布过滤后立即装入保温瓶中，并通入二氧化碳(CO2)保持厌氧条件，迅速带回实验室进行体外发酵试验。基础饲粮组成及营养水平见表2。
缓冲液的配制：瘤胃缓冲液的配制参照Goering等[11]的方法，将520.2 mL蒸馏水，0.1 mL A液，208.1 mL B液，208.1 mL C液，1 mL D液，62.4 mL E液于2 000 mL锥形瓶中混合均匀，进行39 ℃恒温水浴，期间不断通入二氧化碳直至缓冲液接近无色。
体外培养：体外培养采用ANKOM RFS体外产气系统。准确称量1 g发酵底物放入250 mL产气瓶中，放入39 ℃恒温气浴振荡器预热60 min。将预先经39 ℃水浴解冻好的瘤胃液经4层纱布过滤后，按1∶4与预先配制好的混合缓冲液均匀混合，期间不断通入二氧化碳保证其处于厌氧环境。准确量取150 mL混合瘤胃液加入到每个产气瓶中，然后迅速拧紧产气瓶盖子。将其置于39 ℃的恒温气浴振荡器中，进行体外培养72 h，同时进行空白试验。提前制冰，将编号的尼龙袋烘干称重，培养结束后停止记录，保存数据，将产气瓶放在冰上终止发酵，立即测定pH，用尼龙袋将发酵液过滤，液体分装于3个50 mL离心管中，置于-20 ℃保存，用于测定发酵参数，用纯水将产气瓶中的残渣冲至尼龙布上，将尼龙布置于65 ℃烘箱中烘48 h，称重，计算干物质降解率。
1.1.3 添加异位酸对牦牛瘤胃体外发酵产气量、 发酵参数和养分降解率的影响试验
以筛选出的箭筈豌豆和燕麦组合为发酵底物，分别添加3个水平的异丁酸、2-甲基丁酸和戊酸进行体外发酵试验。试验共10个处理，每个处理5个重复，异位酸种类及添加水平见表3。试验步骤同1.1.2，发酵72 h后，记录并保存72 h产气量，收集发酵产物样品进行养分降解率及MCP、氨态氮(NH3-N)、VFA含量的测定，评价添加3种异位酸对牦牛瘤胃体外发酵产气量、 发酵参数和养分降解率的影响。
1.2 试验材料
异丁酸、2-甲基丁酸和戊酸由某公司提供，纯度>95%。体外产气的发酵底物采用箭筈豌豆和燕麦，其中箭筈豌豆采集自四川省甘孜县贡隆乡(海拔3 354 m)，为新牧草，65 ℃烘干制备为风干样品；
燕麦采集自四川省甘孜县庭卡乡(海拔3 500 m)，为收割储备的燕麦干草样品。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 常规养分测定
每个样品取2个平行，以平均值为最终测定结果，不平行样品需重新取样测定，测定指标包括干物质(DM)、粗脂肪(EE)、粗蛋白质(CP)、粗灰分(Ash)、NDF、酸性洗涤纤维(ADF)、中性洗涤不溶蛋白(NDIP)、酸性洗涤不溶蛋白(ADIP)和酸性洗涤木质素(ADL)含量，测定方法参考《饲料分析及饲料质量检测技术》[12]。
1.3.2 NPN含量测定
采用三氯乙酸法[13]测定NPN含量，具体方法为：称取0.5 g待测样品于125 mL锥形瓶中，加入50 mL蒸馏水，静置0.5 h后加入10 mL 10%三氯乙酸溶液，静置20～30 min，使用Whatman#541或#54滤纸过滤，残渣使用三氯乙酸溶液冲洗2次，再转移至凯氏定氮仪测定氮含量。
1.3.3 可溶性蛋白(SOLP)含量测定
参照硼酸-磷酸盐缓冲液法[14]测定SOLP含量，具体方法为：称取0.5 g样品，置于锥形瓶中，加入50 mL硼酸盐-磷酸盐缓冲溶液，再加入1 mL 10%叠氮化钠，室温静置3 h，真空抽滤，滤渣定氮。
1.3.4 淀粉(Starch)含量测定
淀粉含量测定方法参照蒽酮法[15]。
1.3.5 CNCPS组分
CNCPS根据饲料在瘤胃中的降解特性将饲料中蛋白质分为非蛋白氮(PA)、真蛋白(PB)、不可降解蛋白(PC)，根据降解速率又将PB分为快速降解蛋白(PB1)、中速降解蛋白(PB2)和慢速降解蛋白(PB3)；
将饲料中的碳水化合物(CHO)分为快速降解碳水化合物(CA)、中速降解碳水化合物(CB1)、慢速降解碳水化合物(CB2)和不可降解碳水化合物(CC)。参根据Sniffen等[16]的公式计算CNCPS组分，各组分计算公式如下：
PA(%CP)=NPN(%SOLP)×0.01×
SOLP(%CP)；
PB1(%CP)=SOLP(%CP)-PA(%CP)；
PB2(%CP)=100-PA(%CP)-PB1(%CP)-
PB3(%CP)-PC(%CP)；
PB3(%CP)=NDIP(%CP)-ADIP(%CP)；
PC(%CP)=ADIP(%CP)；
CHO(%DM)=100-CP(%DM)-EE(%DM)-
Ash(%DM)；
NSC(%CHO)=100-CB2(%CHO)-
CC(%CHO)；
CA(%CHO)=[(100-Starch(%NSC)]×
[l00-CB2(%CHO)-CC(%CHO)]/100；
CB1(%CHO)=Starch(%NSC)×[(100-
CB2(%CHO)-CC(%CHO))]/100；
CB2(%CHO)=100×{[(NDF(%DM)-
NDIP(%CP)×0.01×CP(%DM)-NDF(%DM)×
0.01×ADL(%NDF)×2.4)]/CHO(%DM)}；
CC(%CHO)=[100×(NDF(%DM)×0.01×
ADL(%NDF)×2.4]/CHO(%DM)。
1.3.6 产气量(gas production，GP)测定
根据ANKOM RFS产气测量系统操作说明，在39 ℃时，将产气压力换算为体积：
Vx=Vj×Ppsi×0.068 004 084。
式中：Vx为39 ℃时产气体积(mL)；
Vj为模块瓶内液面上部空间的体积(mL)；
Ppsi为GPM软件记录的累积压力(psi)，1 psi≈6.89 kPa。
1.3.7 pH测定
培养结束后，立即用冰水浴终止发酵，立即用pH计(pHS-10)测定pH。
1.3.8 养分降解率测定
用尼龙布过滤培养液，将培养液于-20 ℃保存，用于测定NH3-N、VFA和MCP含量；
发酵残渣于65 ℃烘箱中烘干，测定养分(DM、NDF和ADF)降解率[17]。
1.3.9 瘤胃发酵参数测定
取发酵后经过滤的发酵液测定瘤胃发酵参数，NH3-N含量测定采用冯宗慈等[18]改进的比色法，VFA含量测定采用Agilent 6890 N气相色谱仪(测定发酵液中乙酸、丙酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的含量，以2-乙基丁酸作为内标物，采用内标校正定量方法进行计算[17])。MCP含量测定：将瘤胃液于39 ℃下水浴解冻，取5 mL瘤胃液于10 mL离心管中，经超声破碎后(功率350 W，破碎9次，每次15 s，间隔5 s)于2 433×g离心10 min，取1 mL上清液，于4 ℃下16 200×g离心20 min，弃去上清，用1 mL生理盐水(0.85%)冲洗沉淀，再在4 ℃下16 200×g离心20 min，重复2次，所得沉淀即为MCP，加入1 mL蒸馏水重悬作为待测液[19]，按索莱宝生物科技有限公司BCA蛋白定量测试盒说明书测定。
1.3.10 组合效应指数计算
单项组合效应指数(single factor associative effects index，SFAEI)及多项组合效应指数(multiply factor associative effects index，MFAEI)具体计算公式如下：
SFAEI=(组合后实测值-加权估计值)/
加权估计值；
加权估计值=箭筈豌豆样品的实测值×
所占比例+燕麦样品的实测值×所占比例。
MFAEI为多个单向组合效应指数之和[20]。
1.4 数据统计分析
通过SPSS 20.0数据分析软件对数据进行统计分析。CNCPS数据采用独立样本t检验分析；
产气量采用重复测量数据双因素或三因素方差分析，利用一般线性模型(GLM)对数据进行球形检验，多重比较选择Duncan氏法进行检验；
对发酵底物组合筛选试验的其他指标采用单因素方差分析，对添加异位酸发酵试验的其他指标采用双因素方差分析。数据以平均值±标准差表示，显著性水平为P<0.05。
2.1 箭筈豌豆和燕麦的养分含量和CNCPS组分含量
由表4可知，箭筈豌豆和燕麦的DM含量都在88%以上；
箭筈豌豆的CP含量为25.47%，显著高于燕麦(P<0.05)；
箭筈豌豆的NDF含量为43.79%，显著低于燕麦(P<0.05)；
箭筈豌豆的NDIP和ADIP含量显著低于燕麦(P<0.05)。以上结果提示，箭筈豌豆的营养品质要优于燕麦。
表4 箭筈豌豆和燕麦养分含量(干物质基础)
由表5可知，箭筈豌豆的PC含量显著低于燕麦(P<0.05)，表明其蛋白质品质优于燕麦。燕麦的CHO、CB1和CB2含量显著高于箭筈豌豆(P<0.05)，而CC含量显著低于箭筈豌豆(P<0.05)，表明燕麦的CHO品质优于箭筈豌豆。综合来看，箭筈豌豆和燕麦作为牦牛用饲草都具有较好的营养价值。
2.2 箭筈豌豆与燕麦不同底物组合体外发酵的组合效应
由表6可知，箭筈豌豆和燕麦不同底物组合与时间之间存在显著交互作用(P<0.05)，但是不同底物组合对累计产气量无显著影响(P>0.05)。时间对累积产气量产生显著影响(P<0.05)，各组产气量随着发酵时间延长显著增加(P<0.05)。
由表7可知，随着底物组合中燕麦添加比例增加，DM、NDF和ADF降解率呈现先增加后降低的变化规律，其中组合2的DM、NDF和ADF降解率最高，显著高于组合5(P<0.05)，而组合2的pH则显著低于组合1与组合5(P<0.05)。随着底物组合中燕麦添加比例增加，NH3-N含量呈现线性降低规律，且各组合之间差异显著(P<0.05)；
MCP含量先增加后降低，其中组合2和组合3的MCP含量显著高于其他组合(P<0.05)。
表5 箭筈豌豆和燕麦CNCPS组分含量(干物质基础)
表6 箭筈豌豆与燕麦不同底物组合的累积产气量
由表8可知，以SFAEI评估各项指标时，除pH外，其他指标的SFAEI均为正值，表明箭筈豌豆和燕麦不同底物组合的多项组合效应为正组合效应。以MFAEI评估不同组合时，其效应值随组合中燕麦含量的增加呈现先升高后降低的趋势，其中组合3的MFAEI为0.661 8，高于组合2和组合3，因此采用组合3(50%箭筈豌豆+50%燕麦)作为后续试验的发酵底物。
表7 箭筈豌豆与燕麦不同底物组合的体外发酵参数和养分降解率
表8 箭筈豌豆与燕麦不同底物组合体外发酵的组合效应指数
2.3 添加异位酸对牦牛瘤胃体外发酵产气量、 发酵参数和养分降解率的影响
2.3.1 72 h累积产气量
由表9可知，异位酸种类、添加水平与发酵时间对牦牛瘤胃体外发酵72 h累积产气量不存在显著交互作用(P>0.05)，其中异位酸种类与发酵时间、异位酸添加水平与发酵时间对牦牛瘤胃体外发酵72 h累积产气量存在显著交互作用(P<0.05)。随着发酵时间的延长，各组的累积产气量显著增加(P<0.05)。与空白对照组相比，添加异丁酸显著降低72 h累积产气量(P<0.05)，并且添加异丁酸的72 h累积产气量也显著低于添加2-甲基丁酸和戊酸(P<0.05)。随着异位酸添加水平的增加，72 h累积产气量呈现先降低后增加的变化趋势，其中0.3%添加水平的72 h累积产气量显著低于0和0.9%添加水平(P<0.05)。
2.3.2 养分降解率和发酵参数
由表10可知，异位酸种类与添加水平对牦牛瘤胃体外发酵DM、NDF和ADF降解率以及pH、NH3-N和MCP含量无显著交互作用(P>0.05)。异位酸种类和添加水平也分别对牦牛瘤胃体外发酵DM、NDF和ADF降解率无显著影响(P>0.05)。异位酸种类显著影响牦牛瘤胃体外发酵pH、NH3-N和MCP含量(P<0.05)。与空白对照组相比，添加异丁酸、2-甲基丁酸和戊酸能显著降低NH3-N含量(P<0.05)，其中添加戊酸的NH3-N含量还显著低于添加异丁酸和2-甲基丁酸(P<0.05)。异位酸添加水平显著影响牦牛瘤胃体外发酵NH3-N和MCP含量(P<0.05)。与0添加水平相比，NH3-N含量在添加水平为0.3%、0.6%和0.9%时显著降低(P<0.05)，其中在添加水平为0.3%时的最低；
MCP含量呈现先增加后降低的趋势，在添加水平为0.9%时最低，显著低于其他添加水平(P<0.05)，提示异位酸添加水平过高可能会抑制体外发酵体系中微生物的增殖。
表9 添加异位酸对牦牛瘤胃体外发酵72 h累积产气量的影响
9Items Time/h4816243648720.6%17.87±1.83b29.08±3.69c65.66±13.38b90.06±15.02b113.41±14.31ab124.95±12.08ab133.46±11.64ab0.9%24.17±3.41a40.89±7.03b83.87±14.00a104.50±16.84a126.87±15.16a138.11±14.09a146.89±14.51aP P-value×× Type×supplemental level×time0.161× Type×time<0.001× Supplemental level×time0.008× Type×supplemental level0.571 Time<0.001 Type<0.001 Supplemental level<0.001
表10 添加异位酸对牦牛瘤胃体外发酵养分降解率和发酵参数的影响
10ItemsDMD/%NDFD/%ADFD/%pHNH3-N/(mg/dL)MCP/(mg/dL) Supplemental level068.51±4.1253.93±5.8953.70±5.806.75±0.0427.25±0.59a57.29±0.66a0.30%70.81±2.3956.01±2.4753.46±3.596.78±0.0424.14±0.78c59.21±5.33a0.60%71.06±3.0157.29±5.1855.53±6.916.76±0.0624.68±1.65bc58.53±4.98a0.90%69.76±3.1756.56±5.7355.93±6.426.76±0.0225.30±1.56b51.63±5.98bP P-value×Type×supplemental level0.6300.7060.5490.9810.2620.087 Type0.1350.6340.6400.040<0.001<0.001Supplemental level0.4520.7770.4830.4110.006<0.001
2.3.3 VFA含量
由表11可知，异位酸种类与添加水平对牦牛瘤胃体外发酵除戊酸含量及乙酸/丙酸之外的VFA含量均存在显著交互作用(P<0.05)。异位酸种类极显著影响了牦牛瘤胃体外发酵VFA含量(P<0.05)，其中与空白对照组相比，添加2-甲基丁酸显著增加了乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和总挥发性脂肪酸(TVFA)含量(P<0.05)，且显著高于添加异丁酸和戊酸(P<0.05)；
添加异丁酸显著增加了异丁酸含量(P<0.05)，且显著高于和添加2-甲基丁酸和戊酸(P<0.05)；
添加戊酸显著增加了戊酸含量(P<0.05)，且显著高于添加异丁酸和2-甲基丁酸(P<0.05)。但是与空白对照组相比，添加戊酸显著降低了乙酸、丙酸和TVFA含量(P<0.05)。异位酸添加水平对瘤胃体外发酵除乙酸和丁酸含量之外的VFA含量和乙酸/丙酸产生显著影响(P<0.05)。随着异位酸添加水平的增加，丙酸、戊酸和TVFA含量呈现先增加后降低的趋势，在0.6%添加水平最高，均显著高于0和0.9%添加水平(P<0.05)；
而异丁酸、异戊酸含量呈现线性增加趋势，在0.9%添加水平最高，显著高于0和0.3%添加水平(P<0.05)。
表11 添加异位酸对牦牛瘤胃体外发酵VFA含量的影响
11ItemsAcetic acid/(mmol/L)Propionic acid/(mmol/L)Butyric acid/(mmol/L)Isobutyric acid/(mmol/L)Valeric acid/(mmol/L)Isovaleric acid/(mmol/L)/Acetic acid/propionic acidTotal volatile fatty acids/(mmol/L) Valeric acid0.30%12.84±1.554.82±1.291.67±0.390.27±0.070.63±0.140.41±0.122.77±0.5720.65±3.250.60%11.64±2.124.37±1.071.43±0.590.23±0.100.81±0.090.37±0.192.72±0.4418.85±3.900.90%10.57±1.163.34±0.891.40±0.390.22±0.060.64±0.140.40±0.113.28±0.5716.56±2.66 Main effects TypeBlank control group16.65±2.16b5.44±1.01c1.79±0.19b0.32±0.14c0.44±0.09c0.51±0.10b3.14±0.61a25.14±2.38b Isobutyric acid15.08±3.01b6.53±1.69b1.48±0.42b0.68±0.25a0.39±0.14c0.45±0.12b2.43±0.73b24.62±4.52b2- 2-methybutyric acid24.17±2.74a7.78±1.14a2.47±0.27a0.44±0.10b0.57±0.09b1.21±0.38a3.13±0.31a36.65±3.90a Valeric acid11.68±1.81c4.18±1.20d1.50±0.45b0.24±0.08c0.69±0.14a0.39±0.14b2.92±0.56a18.69±3.52c Supplemental level016.65±2.165.44±1.01b1.79±0.190.32±0.14c0.44±0.09b0.51±0.10c3.14±0.61a25.14±2.38b0.30%17.11±7.246.78±1.98a1.73±0.720.36±0.12bc0.49±0.18b0.55±0.27bc2.52±0.62b27.02±9.96ab0.60%17.56±5.136.81±1.97a1.81±0.580.45±0.23b0.63±0.17a0.68±0.42ab2.62±0.41b27.95±7.70a0.90%16.28±5.434.89±1.55b1.90±0.510.54±0.31a0.43±0.15b0.83±0.58a3.35±0.45a24.98±8.00bP P-value×Type×supplemental level<0.0010.0040.003<0.0010.8010.0010.082<0.001 Type<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 Supplemental level0.133<0.0010.374<0.0010.003<0.001<0.0010.020
3.1 箭筈豌豆和燕麦的养分含量和CNCPS组分含量
本试验测得燕麦的CP含量为5.57%，含量较低，低于付洋洋等[21]测得四川省阿坝州燕麦干草的CP含量(8.42%)，与殷满财等[22]测得青海地区燕麦干草的CP含量(4.1%)接近，NDF和ADF含量与付洋洋等[21]的结果相近，高于殷满财等[22]的结果。箭筈豌豆的CP含量为25.47%，与陈玲玲等[23]测定的赤峰地区箭筈豌豆的CP含量(25.23%)相近，高于Karabulut等[24]测定的箭筈豌豆的CP含量(18.1%)，提示不同产地的燕麦和箭筈豌豆由于生长环境和收割季节的差异，从而影响其养分的组成。CNCPS组分含量中，燕麦NDIP和ADIP含量高于箭筈豌豆，且箭筈豌豆PC含量较低，表明箭筈豌豆更容易被动物消化，但燕麦的淀粉和CHO含量较高，可为反刍动物提供能量，而箭筈豌豆的CHO含量较低，CC含量较高。一般来说，豆科牧草与禾本科牧草的蛋白质和CHO含量差异较大，与禾本科牧草相比，豆科牧草蛋白质含量较高，CHO含量较低[23]。综合来看，燕麦的CHO含量较高，箭筈豌豆的蛋白质含量高，为更好利用2种牧草，平衡营养成分，提示牦牛饲草中可将箭筈豌豆与燕麦进行一定比例组合，以提高2种牧草的消化率。
3.2 箭筈豌豆与燕麦不同底物组合体外发酵的组合效应
瘤胃降解饲料产生的气体主要来源于微生物对饲料中蛋白质和CHO含碳部分的降解，可在一定程度上反映瘤胃微生物对饲料的利用效率[25]。CHO含量较高的牧草的产气量高于蛋白质含量较高的牧草，随着体外发酵时间延长，产气量也逐渐累积[26]。本试验中，同样也观察到随着发酵底物组合中燕麦添加比例增加产气量呈上升的趋势，可能是由于燕麦的CHO含量高于箭筈豌豆，随着其比例增加从而提高了产气量。
除了产气量，本试验还发现随着燕麦添加比例增加，DM、NDF和ADF降解率均降低。贾泽统[27]探究了不同比例苜蓿草与燕麦草组合对奶牛生产性能的影响，发现随着燕麦草的添加比例升高，奶牛的生产性能降低，这是由于燕麦草的纤维素含量高于苜蓿草，蛋白质含量低于苜蓿草，造成生产性能下降，因此推测DM、NDF和ADF降解率随燕麦含量增加而降低与底物组合中纤维素含量逐渐增加有关。刁波等[28]将燕麦与天然牧草组合发现，随着燕麦添加比例增加，NH3-N含量逐渐降低，与本试验中结果一致。NH3-N主要来自饲草中蛋白质降解，本试验用发酵底物箭筈豌豆CP含量显著高于燕麦，所以当底物组合中箭筈豌豆添加比例较高时，蛋白质分解较快，不能及时被微生物合成MCP，造成NH3-N含量增加。MCP含量随着燕麦添加比例增多呈现先增加后降低的规律，其中箭筈豌豆与燕麦比例为75∶25以及50∶50时显著高于其他组合，表明箭筈豌豆和燕麦进行组合能提高饲草蛋白质向MCP的转化率。根据MFAEI结果，本研究确定将50%箭筈豌豆+50%燕麦作为体外发酵底物组合。
3.3 添加异位酸对牦牛瘤胃体外发酵产气量、养分降解率和发酵参数的影响
本试验发现，与空白对照组相比，添加异丁酸能够显著降低发酵72 h的累积产气量，而添加2-甲基丁酸和戊酸对72 h的累积产气量影响不大。这可能是由于异位酸的加入对瘤胃中某些特定细菌具有抑菌活性[29]；
程桂英[30]试验也表明，添加不同异位酸会改变瘤胃细菌区系的组成，且每种异位酸有各自的优势菌群。此外，不同试验条件下发酵底物和瘤胃液中微生物存在差异，最终降低了产气量。
本试验中，添加不同种类及不同水平的异位酸对DM、NDF、ADF降解率无显著影响，龙际飞等[31-32]在体外发酵中添加戊酸，发现0.3%戊酸组NDF降解率与对照组差异不显著，但随着戊酸添加水平增加，NDF降解率显著降低；
在体外发酵中添加2-甲基丁酸，NDF降解率先升高后降低，但无显著差异。在体内试验中，刘强等[33]在西门塔尔牛饲粮中添加异丁酸和异戊酸，发现能显著提高玉米秸秆的NDF和ADF降解率。饲粮中添加2-甲基丁酸也同样可以提高DM、NDF和ADF降解率[34-36]。邵广[37]在奶牛饲粮中添加2-甲基丁酸，发现可显著提高NDF和ADF降解率，DM降解率也有提高的趋势，提示异位酸能提高纤维分解菌的活性，其促进饲料降解率的作用与异位酸种类、添加水平和饲料底物有关，且在体内饲养试验作用效果优于体外发酵试验。
pH可以反映瘤胃环境的状况，适宜的pH为6.2～7.0，在这区间瘤胃微生物能正常生长繁殖，在本试验中，添加异位酸对pH无显著影响，与前人研究结果[37-38]一致，表明添加异位酸不会改变瘤胃的发酵环境，微生物能正常生长繁殖。NH3-N和MCP可以反映瘤胃微生物对氮的转化和利用，研究表明瘤胃适宜的NH3-N含量为6.3～27.5 mg/dL[39]。本试验中，NH3-N含量均在适宜范围内，并且添加异位酸能显著降低NH3-N含量，这与前人的试验结果[40-41]一致，表明添加异位酸能提高微生物对氮的利用。本试验中，添加2-甲基丁酸能提高MCP含量，而添加异丁酸会降低MCP含量，这与前人的研究结果[42]不一致。NH3-N含量受到饲粮中CP降解速度和MCP合成速度的影响，NH3-N含量降低但MCP含量并未升高，这可能是由于异丁酸的添加水平较高，CP的降解速度受到了限制，导致NH3-N和MCP含量下降。
VFA是瘤胃微生物利用CHO发酵后的产物，能为反刍动物提供所需能量的70%～80%。本试验中，添加2-甲基丁酸均显著提高了各种VFA和TVFA含量，其中在提高乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸以及TVFA含量上效果优于异丁酸和戊酸。李鹤琼等[41]在犊牛饲粮中添加2-甲基丁酸，发现可显著提高30日龄瘤胃乙酸含量。周胜花等[43]在荷斯坦奶牛饲粮中添加2-甲基丁酸，发现瘤胃乙酸、丁酸和TVFA含量显著增加，与本试验结果一致，表明2-甲基丁酸能增加VFA含量。添加异丁酸虽然对MCP合成有抑制作用，但对瘤胃中丙酸和异丁酸生成有促进作用，其中在0.6%添加水平时丙酸含量显著增加，改善对能量的代谢和利用。上述结果提示，添加不同种类的异位酸对VFA含量的影响研究结果并不一致，主要受异位酸种类、添加水平和发酵底物营养成分差异影响。
箭筈豌豆蛋白质品质优于燕麦，而CHO品质低于燕麦；
50%箭筈豌豆+50%燕麦为牦牛瘤胃体外发酵最佳底物组合；
添加0.3% 2-甲基丁酸或0.3%戊酸能够改善牦牛瘤胃体外发酵参数。