付劭静，周延华，卑红喆，姜连堃，杨月明
[1.内蒙古医科大学第三附属医院（内蒙古包钢医院）神经内科，内蒙古包头 014000；
2.内蒙古医科大学第三附属医院（内蒙古包钢医院）药剂科，内蒙古包头 014000]
卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）属于卒中后的一种多发性、情感性精神障碍类疾病，典型的临床表现包括情绪低落、严重失眠、头晕头痛、肠胃不适、记忆力下降、暴躁易怒等。有数据[1-2]显示，PSD越来越常见，发生率不减反增。与非抑郁患者相比，PSD患者病情进展更快，研究[1，3]表明，PSD可增加患者的死亡风险及病死率。在PSD治疗中有效缓解患者抑郁状态对疾病控制和病情康复有重要的临床意义。中医药具有相对安全、多效应、效果持久等优点，逐渐成为该领域的研究热点。经典方剂逍遥散出自《太平惠民和剂局方》，有疏肝解郁、养血健脾功效，为中医学领域首选抗抑郁的中药复方[4]。已有研究[5-7]表明逍遥散发挥抗抑郁作用，可被用于治疗应激诱发的精神性疾病，诸如偏头痛、抑郁焦虑、失眠症以及帕金森病等。本研究通过构建PSD大鼠模型，进一步探讨逍遥散的干预机制，旨在为其临床应用治疗PSD提供参考依据，现将研究结果报道如下。
1.1 实验动物50只SPF级U14品系雄性SD大鼠，30周龄，体质量320～350 g，购自内蒙古大学实验动物中心，许可证号：SCXK（蒙）20030001。饲养环境和条件：饲养于本实验动物中心实验室，每笼5只（7 d后，对于随机选取的拟造模大鼠采取单笼饲养），饲养温度控制在25℃，相对湿度控制在53%～55%，通风换气10次/h，光照、黑暗按照12 h/12 h交替变化，期间大鼠自由获取食物和水。
1.2 药物逍遥散组成：北柴胡、白芍、当归、白术、茯苓各30 g，薄荷、煨姜各10 g，炙甘草15 g。以上中药材均购自内蒙古东诚中药有限公司，由本院中药研究中心专业姜连堃中药师鉴定。常规方法煮沸、浓缩至实验目的浓度。
1.3 试剂与仪器尼氏染色法试剂盒（上海哈灵生物科技有限公司）；
一氧化氮合酶（iNOS）、白细胞介素10（IL-10）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附分析（ELISA）检测试剂盒由北京全式金生物技术有限公司提供；
五羟色胺（5-HT）、五羟吲哚丁酸（5-HIAA）ELISA检测试剂盒由天津市广成化学试剂有限公司提供；
兔抗鼠谷氨酸转运体1（GLT-1）、脑源性神经营养因子（BDNF）、Caspase-9和Caspase-3及其剪切体、GAPDH等抗体由美国Abcam公司提供；
羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）标记的免疫球蛋白（IgG）由美国Abcam公司提供；
二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒、蛋白免疫印迹（Western Blot）化学发光试剂盒由美国Thermo公司提供；
Bradford蛋白定量试剂盒由北京全式金生物技术有限公司提供；
TRIzol RNA提取试剂由美国Gibco公司提供。酶标仪由美国Thermo公司提供；
光学显微镜由日本Nikon公司提供；
凝胶成像分析仪由法国Vilber Lourm公司提供；
紫外分光光度计由美国Beckman公司提供）；
电泳仪和电泳槽，由北京索莱宝科技有限公司提供。
1.4 PSD大鼠模型的建立造模方法参考贺旭等[8]方法，采用四血管阻断法构建大鼠缺血性脑卒中模型。四血管阻断法：1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧固定于脑立体定位仪台面，沿颈部正中线一侧行手术切口，钝性分离颈部两侧颈总动脉，电凝大鼠两侧椎动脉，第2天采用乙醚吸入麻醉，外科缝线拉出颈总动脉，微动脉夹阻塞血管30 min后再灌注。若大鼠出现瞳孔放大、呼吸加深、翻正反射消失，则判断卒中模型制作成功[8]。卒中模型制作成功7 d后，采用社会隔离+慢性不可预见性温和应激（CUMS）方法制备PSD大鼠模型。CUMS方法主要包括禁食水、束缚、噪音、夹尾、冰水、热水、倾斜、异物等各种不同的应激刺激，每日1种刺激，连续6周，随机交替进行。
1.5 给药与分组将造模成功的大鼠随机分为模型组及逍遥散低、中、高剂量组，每组各10只，另将剩余的10只大鼠设为正常组。造模的同时，逍遥散低、中、高剂量组分别对应给予4.5、9、18 g·kg-1·d-1（生药）逍遥散煎剂灌胃，正常组、模型组灌胃等体积的生理盐水，每日1次，连续给药6周。
1.6 观察指标与方法
1.6.1 采用Zea-Longa法[9]评价大鼠神经功能损伤情况 采用Zea-Longa 5级评分法，分值范围为0～4分，分值高低与神经功能缺损程度呈正相关，其中0分表示正常，1分表示左前肢不能完全伸展，2分表示向左转圈，3分表示向左倾倒，4分表示意识丧失，不能行走。
1.6.2 苏木素-伊红（HE）染色法观察脑组织病理形态学变化 颈椎脱臼法处死大鼠，于冰上解剖取出脑组织，40 g/L多聚甲醛固定，依次脱水、石蜡包埋、切片，HE染色，光学显微镜下观察各组脑组织病理形态学变化情况，拍照记录。
1.6.3 尼氏染色法检测脑组织神经细胞凋亡情况 按照上述“1.6.2”项中同样方法制作石蜡切片，常规脱蜡至水，用50℃甲苯胺蓝水溶液浸染15 min后，立即用水洗一遍，然后按照常规方法进行脱水，依次二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ分别透明10 min，封片，最后于显微镜下观察和拍照。
1.6.4 酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血液中iNOS、TNF-α、IL-10和脑组织5-HT及其代谢物5-HIAA水平 具体操作步骤按照试剂盒说明书进行，应用酶标仪检测。
1.6.5 Western Blot法检测脑组织GLT-1、BDNF，Caspase通路相关蛋白（Caspase-9、Caspase-3及其剪切体）等蛋白相对表达水平 取出冻存的脑组织，提取总蛋白，BCA定量试剂盒测定总蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离蛋白后进行转膜、封闭；
分别加入稀释后的一抗GLT-1、BDNF、Caspase-9及其剪切体、Caspase-3及其剪切体以及GAPDH（除GAPDH以1∶100稀释外，其余抗体均以1∶1 000稀释），4℃冰箱孵育过夜；
TBST洗3～5次，15 min/次，室温孵育二抗1 h；
TBST洗3～5次，15 min/次，利用Western Blot化学发光试剂盒显色和拍照。最后采用凝胶成像分析仪扫描各Western Blot条带灰度值并进行分析，结果以目的蛋白与内参（GAPDH）的灰度值比值表示。
1.6.6 实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测脑组织超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）mRNA表达水平 SOD上游引物序列为5’-CTTCC TCCCTTTAACTTATCCATTCAC-3’，下游引物序列为5’-CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATAC-3’；
MDA上游引物序列为5’-CAGGAAACAGCTATGA CC-3’，下游引物序列为5’-TGTAAAACGACGGC CAGT-3’。提取脑组织总RNA，进行反转录。以20μL反应体系进行检测，反应体系：1×SYBR Green I master-mix、0.5μmol/L特异反向引物、0.5μmol/L特异前向引物、1μL反转录产物。反应条件：预变性95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，72℃30 s，共循环40次。应用ABI 7600仪器进行RT-PCR，样品均设3个复孔。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct管家基因，ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt。
1.7 统计方法所有实验均重复3次。采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较图1结果显示：与正常组比较，模型组神经功能缺损评分显著升高（P＜0.05）；
与模型组比较，逍遥散低、中、高剂量组神经功能缺损评分均显著降低，其中，逍遥散中、高剂量组的差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.2 各组大鼠脑组织病理形态学变化比较图2结果显示：正常组海马组织细胞界限、细胞内结构（如核膜、核仁等）均清晰可见，海马锥体细胞排列较为紧密，间质无水肿，细胞核圆又大、染色淡；
模型组海马组织细胞界限模糊，海马锥体细胞排列混乱、模糊，部分细胞核发生皱缩，染色较深，间质有水肿现象；
与模型组比较，逍遥散低、中、高剂量组脑组织病理形态均得到不同程度的改善，其中逍遥散高剂量组最优、逍遥散中剂量组次之。
2.3 各组大鼠脑组织神经细胞凋亡情况比较图3结果显示：正常组可见较多的尼氏小体；
模型组、逍遥散低剂量组几乎没有尼氏小体；
逍遥散中剂量组、逍遥散高剂量组可见较多的尼氏小体，且逍遥散高剂量组较逍遥散中剂量组可见更多的尼氏小体。
2.4 各组大鼠脑组织5-HT、5-HIAA含量比较图4结果显示：与正常组比较，模型组大鼠脑组织5-HT、5-HIAA含量均显著降低（P＜0.05）；
与模型组比较，逍遥散低、中、高剂量组大鼠脑组织5-HT、5-HIAA含量均显著升高，其中，逍遥散中、高剂量组的差异有统计学意义（P＜0.05）。
图1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（±s）Figure 1 Comparison of neurological deficit scores between various groups of rats（±s）
2.5 各组大鼠血清iNOS、TNF-α、IL-10含量比较图5结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血清iNOS、TNF-α、IL-10含量均显著升高（P＜0.05）；
与模型组比较，逍遥散低、中、高剂量组大鼠血清iNOS、TNF-α含量均显著降低，IL-10含量均显著升高，其中，逍遥散中、高剂量组的差异有统计学意义（P＜0.05）。
图2 各组大鼠脑组织病理形态学变化比较（HE染色）Figure 2 Comparison of histomorphological changes in the brain tissue between various groups of rats（by HE staining）
图3 各组大鼠脑组织神经细胞凋亡情况比较（尼氏染色）Figure 3 Comparison of apoptosis of neuralcells in brain tissue between various groups of rats（by Nisslstaining）
2.6 各组大鼠脑组织SOD、MDA mRNA表达比较图6结果显示：与正常组比较，模型组脑组织SOD mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），MDA mRNA表达水平均显著升高（P＜0.05）；
与模型组比较，逍遥散低、中、高剂量组脑组织SOD mRNA表达水平均显著升高，MDA mRNA表达水平均显著降低，其中，逍遥散中、高剂量组的差异有统计学意义（P＜0.05）。
图4 各组大鼠脑组织5-HT、5-HIAA含量比较（±s）Figure 4 Comparison of 5-HT and 5-HIAA contents in brain tissue in various groups of rats（±s）
2.7 各组大鼠脑组织Caspase-9、Caspase-3及其剪切体表达情况比较图7结果显示：与正常组比较，模型组大鼠脑组织Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Cleaved Caspase-3/Caspase-3水平均显著升高（P＜0.05）；
与模型组比较，逍遥散低、中、高剂量组大鼠脑组织Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Cleaved Caspase-3/Caspase-3水平均显著降低，其中，逍遥散中、高剂量组的差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.8 各组大鼠脑组织GLT-1、BDNF蛋白表达比较图8结果显示：与正常组比较，模型组大鼠脑组织GLT-1、BDNF蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）；
与模型组比较，逍遥散低、中、高剂量组大鼠脑组织GLT-1、BDNF蛋白表达水平均显著升高，其中，逍遥散中、高剂量组的差异具有统计学意义（P＜0.05）。
图5 各组大鼠血清iNOS、TNF-α、IL-10含量比较（±s）Figure 5 Comparison of serum iNOS，TNF-αand IL-10 levels in various groups of rats（±s）
图6 各组大鼠脑组织SOD、MDA mRNA表达比较（±s）Figure 6 Comparison of SOD and MDA mRNA expression in brain tissue between various groups of rats（±s）
图7 各组大鼠脑组织Caspase-9、Caspase-3及其剪切体表达情况比较（±s）Figure 7 Comparison of expression of Caspase-9，Caspase-3 and their shedders in various groups of rats（±s）
图8 各组大鼠脑组织GLT-1、BDNF蛋白表达比较（±s）Figure 8 Comparison of GLT-1 and BDNF protein expression in brain tissue in various groups of rats（±s）
对于卒中后抑郁（PSD）患者需重视抗抑郁治疗[1-3]。PSD发病机制涉及神经、内分泌、免疫等多方面。研究发现，抑郁症患者脑组织出现不同程度的病理学形态变化，推测海马神经细胞损伤与抑郁症发病有关，而凋亡是神经细胞损伤的主要形式之一[10-11]。另有研究[12]发现，氧化应激刺激可以降低机体本身神经元水平，同时会降低机体单胺类神经递质含量，终致抑郁。5-HT为单胺类神经递质分子，5-HIAA是5-HT代谢终产物之一，无生物学活性。5-HT参与调控人类多种行为学现象，与抑郁焦虑、暴躁等性格问题关联密切[13]。又有相关文献报道[14]指出，抑郁症患者的免疫功能会发生一定程度的变化，主要表现为免疫系统过度活跃，诸如细胞因子释放增多、急性炎症反应等。研究发现，身体或心理应激将诱导体内细胞因子释放量增多，给予大鼠心理应激30 min后可检测到IL-10、TNF-α水平急剧上升的状态，上升幅度与给予的刺激时间和刺激强度呈正相关。iNOS、IL-10、TNF-α等是细胞内典型的炎性反应因子，参与调控发热、进食、睡眠、感染等过程，有文献研究[15]表明其水平过高与情绪低落、抑郁以及精神分裂等情感障碍相关。GLT-1是机体内清除突触间隙过高浓度谷氨酸的重要蛋白，可保护神经元免受神经毒性损害[16]。BDNF是机体细胞内重要的神经营养蛋白分子，可促进外周神经元存活和分化。研究[17]表明，BDNF在中枢神经元呈泛表达，有参与维持神经元形态学及行为学调控的功能，与人类精神性疾病相关。
本研究结果显示：模型组大鼠脑组织海马细胞排列紊乱无序，细胞界限以及细胞内结构模糊，细胞核发生皱缩，未见尼氏小体；
模型组大鼠Zea-Longa评分，凋亡相关蛋白Caspase-9剪切蛋白、Caspase-3剪切蛋白，氧化应激产物MDA及炎症因子iNOS水平均显著高于正常组，GLT-1、BDNF、5-HT、5-HIAA、SOD水平均显著低于正常组。表明PSD模型大鼠发生了神经细胞突质性病变，PSD并非完全是功能性主观性疾病，与脑组织海马神经细胞损伤以及氧化应激损伤同样有一定的关联。而逍遥散组脑组织损伤以及氧化应激相关指标均有不同程度改善，表明给予PSD模型大鼠逍遥散干预可修复神经细胞损伤，抑制神经细胞凋亡及氧化应激损伤。本研究还发现，模型组大鼠促炎因子iNOS、TNF-α，抑炎因子IL-10水平较正常组均显著升高，逍遥散组可下调iNOS、TNF-α水平，上调IL-10水平，表明逍遥散可改善PSD大鼠的炎症反应。
综上所述，逍遥散可通过抑制PSD大鼠神经细胞凋亡，调节神经内分泌，改善免疫功能和氧化应激损伤发挥抗抑郁作用。但本研究存在一定局限性，由于时间限制和经费限制，未设阳性对照组，研究结果可能有一定偏倚，有待进一步完善。
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