陈应娥, 梁巧兰, 魏列新, 同发宇, 王 冬
(甘肃农业大学 植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，兰州 730070)
木霉菌是半知菌亚门丝孢纲丝孢目的一类腐生真菌，广泛存在于土壤、根围、叶围及种子和球茎中等，也是重要的生防菌[1-4]。据报道，木霉菌对多种病原菌如尖镰孢菌Fusarium oxysporum、核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、百合疫霉菌Phytophthora cactorum和灰葡萄孢菌Botrytis cinerea等均具有生防拮抗作用[5-6]。研究表明，生防木霉菌株或其发酵液、发酵液蛋白提取物均能提高植物体内与抗病性相关的酶活性，诱导植物产生抗病性，促进植物生长[7-9]，其中TraT2A 是通过对深绿木霉T2 菌株 (Trichoderma atrovirideT2 strain) 发酵液进行离心过滤、盐析、透析、Sephadex G-100 凝胶、柱层析获得的具有激发子活性的蛋白质，可提高植物与抗病性相关的防御酶活性，增加叶片中叶绿素和蜡质含量，降低丙二醛含量，并促进胼胝质的积累，诱导兰州百合对灰霉病产生抗性，减轻该病害的发生[10-13]。
目前，针对百合病害防治主要依赖化学药剂，而化学药剂在使用时由于植物自身或自然环境等因素影响，药效并不能完全发挥，且存在农药残留、污染严重等问题[14-15]，筛选生物药剂已成为发展百合产业、提高百合品质的有效举措。据报道，大蒜鳞茎粗提液、紫茎泽兰提取液及其与沼液混合液等植物源农药[16-17]，放线菌发酵液[18]及申嗪霉素、中生菌素等抗生素类杀菌剂均可有效防治尖孢镰孢菌引起的百合枯萎病。但是，生物农药易受紫外线等环境因素影响，防效发挥不稳定且作用缓慢，影响其在生产实际中的应用。针对此问题，在生物农药研发中通过添加性能更高的农药助剂如紫外保护剂、辅助剂等可改善药剂的理化性能，增加植物对农药有效成分吸收利用率，提高防病效果。研究发现，40 mg/mL TraT2A对兰州百合灰霉病菌抑制率为28.60%，诱导抗病效果大于50%[11,13]，但其受紫外光等环境因素影响较大，在自然条件下稳定性较差，诱导抗病作用的持效期较短。因此，在以TraT2A 为有效成分的生防菌剂研制中筛选添加紫外保护剂和提高有效成分吸收利用率的辅助剂是增加其稳定性、提高其田间使用效果的关键，为此，本研究采用菌丝生长速率法测定了不同浓度下TraT2A 对百合叶斑病菌的抑制作用，对2 种紫外保护剂及3 种能提高植物对TraT2A 吸收利用率的辅助剂进行了优化和筛选，并进行了田间防效试验，旨在为开发对百合叶斑病防治效果较高的TraT2A 制剂提供依据。
1.1 试验材料
供试菌株：百合叶斑病菌Alternaria alternata，由甘肃农业大学植物保护学院农药学实验室提供。
药剂：深绿木霉T2 菌株发酵液蛋白提取物(TraT2A)，由甘肃农业大学植物保护学院农药学实验室发酵提取 (TraT2A 在595 nm 处的OD 值为3.26，产量为800 mL/4 L)[12]；
辅助剂SP-4821A、SP-4821B 和IE-08 均为改性脂质体，一种源自大豆磷脂的辅助剂[19]，由江苏擎宇化工科技有限公司提供；
99%抗坏血酸购自天津市凯信化学工业有限公司；
90%腐殖酸购自湖北省宜都市华明化工有限公司。
仪器设备：UV-9000S 紫外分光光度计 (上海元析仪器有限公司)；
LDZF-75L-11 高压蒸汽灭菌器 (上海申安)；
HPX-II-300 生化培养箱 (上海跃进医疗器械有限公司)；
SQP 电子天平 (赛多利斯科学仪器有限公司)；
HCB-1300V 超净工作台 (青岛海尔生物医疗有限公司)；
HNY-211B 全温度振荡培养箱 (天津欧诺仪器股份有限公司)；
Axio Lab.A1生物显微镜 (Carl Zeiss)。
供试百合品种为兰州百合Lilium davidiiDuch，由兰州市七里河区百合种植基地提供。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖18 g，琼脂粉14 g，蒸馏水加至1 L。
1.2 试验方法
1.2.1 TraT2A 抑菌活性测定 采用菌丝生长速率法[20]：将灭菌的40.00、45.00 和46.67 mL PDA 培养基冷却至45 ℃左右时，分别加入10.00、5.00 和3.33 mL TraT2A，混匀，每个处理分别倒入3 个灭菌培养皿中，制成平板，使TraT2A 在培养基中的质量浓度分别为200.00、100.00 和66.67 mg/mL，以同样的方法加入无菌水作为空白对照；
用打孔器在菌落边缘打取直径5 mm 的菌饼，菌丝朝下接入PDA 平板中央，每个处理重复3 次，置于25 ℃下恒温培养，于4 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，按公式 (1) 计算抑制率 (I)。
式中：DCK为空白对照菌落平均直径，mm；
DPT为处理菌落平均直径，mm。
1.2.2 TraT2A 抑菌条件的优化
1.2.2.1 紫外光照射时间对TraT2A 抑菌活性的影响 取200.00 mg/mL 的TraT2A 分别在紫外光下(波长为280 nm，强度为100 μw/cm2，预热30 min，保证光源稳定性) 照射10、20、30 和40 min，备用；
将灭菌的40 mL PDA 培养基冷却至45 ℃左右时，分别加入10 mL 上述经紫外光照射不同时间的TraT2A，混匀，制成平板，以加入不经过紫外光照射的TraT2A 和无菌水分别作为TraT2A 对照和空白对照，每个处理重复3 次，置于25 ℃下恒温培养，于4 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，按公式 (1) 计算抑制率，分析不同紫外光照射时间对TraT2A 抑菌活性的影响。
1.2.2.2 紫外保护剂对TraT2A 抑菌活性的影响
将紫外保护剂抗坏血酸、腐殖酸250 mg 分别加入到10 mL 200.00 mg/mL 的TraT2A 中，在紫外光下 (波长为280 nm，强度为100 μw/cm2，预热30 min，保证光源稳定性) 照射30 min，备用；
将灭菌的39.75 mL PDA 培养基冷却至45 ℃左右时，分别加入10 mL 上述经过紫外光照射30 min 包含有抗坏血酸、腐殖酸的TraT2A，混匀，以加入未经紫外光照射的TraT2A、经过紫外光照射30 min 的TraT2A 以及无菌水分别作为TraT2A对照、紫外光照射的TraT2A 对照和空白对照，每个处理重复3 次，置于25 ℃下恒温培养，于4 d后采用十字交叉法测量菌落直径，按公式 (1) 计算抑制率，分析不同的紫外保护剂的抑菌活性及其对TraT2A抑菌活性的影响。
1.2.3 辅助剂对TraT2A 抑菌活性的影响 用灭菌水分别溶解辅助剂IE-08、SP-4821A 和SP-4821B，使辅助剂IE-08 的质量浓度为0.50、0.25、0.13、0.07 和0.04 mg/mL；
SP-4821A 和SP-4821B 的质量浓度为0.17、0.09、0.05、0.03 和0.02 mg/mL。分别取1 mL 辅助剂和10 mL 200.00 mg/mL 的TraT2A，同时加入到灭菌冷却至45 ℃的39 mL PDA 培养基中，混匀，每个处理倒入3 个灭菌培养皿中，制成含药培养基。以向40 mL PDA 中加入10 mL 200.00 mg/mL 的TraT2A 和10 mL 无菌水分别作为TraT2A 对照和空白对照，向39 mL PDA 中加入1 mL 辅助剂和10 mL 无菌水的 PDA培养基作为辅助剂对照，每个处理重复3 次，置于25 ℃下恒温培养，于4 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，按公式 (1) 计算抑制率，分析不同浓度的辅助剂的抑菌活性及其对TraT2A 抑菌活性的影响。
1.2.4 TraT2A 与辅助剂混合液对百合叶斑病的田间防效 在甘肃农业大学试验田开展田间药效试验，试验地为壤土，土地平整，土壤肥力一致。将兰州百合种球种植于试验田中，每隔5 d 浇水1 次，定期除草，确保百合幼苗正常生长，备用；
向培养7 d 的交链格孢菌PDA 平板中加入10 mL灭菌水，用接种环在培养基表面轻轻摩擦，使孢子悬浮于灭菌水中，然后用双层纱布过滤，滤液于1 000 r/min 下离心5 min，弃去上清液，沉淀用灭菌水洗涤3 次，用血球计数板镜检计算孢子浓度，并用灭菌水将孢子悬浮液稀释至浓度为1 ×107个/mL；
接种前4 d 向田间灌足水，接种当日于6：00 将交链格孢分生孢子悬浮液以喷雾方式接种于田间生长健壮的、苗龄60 d 的百合幼苗上，喷雾量以叶面完全湿润为宜；
然后把报纸制成直径30 cm、高60 cm 的圆柱筒，套在百合幼苗上，并在其上套上保鲜袋，用于接种苗的遮阳保湿，以确保病原菌孢子萌发和侵染发病，共接种处理150 株，划分为15 个小区，每小区10 株；
根据预试验结果，称取200 g TraT2A，置于1 000 mL烧杯中，加入5 g 紫外保护剂腐殖酸和0.17 g 辅助剂SP-4821A，用灭菌水定容至1 000 mL，混匀，制成TraT2A 混合液，使混合液中TraT2A、腐殖酸和SP-4821A 的质量浓度分别为200.00、5.00和0.17 mg/mL，将此混合液以600 mL/小区的药液量，采用喷雾法对接种后7 d 的百合幼苗叶片均匀喷雾。以喷施200.00 mg/mL TraT2A、5.00 mg/mL腐殖酸、0.17 mg/mL SP-4821A 的接菌百合幼苗分别作为TraT2A 对照、紫外保护剂对照和辅助剂对照，以喷施无菌水的接菌百合幼苗作为空白对照。每处理1 个小区，每小区10 株，重复3 次，每隔10 d 重复喷雾处理1 次，连续处理3 次，于每次施药后10 d 根据病害分级标准调查各处理的百合幼苗发病情况，按公式 (2) 和 (3) 计算病情指数 (DI) 和防治效果 (CE)。
分级标准[21]：0 级：叶片无病斑；
1 级：病斑面积占整个叶面积20%以下；
3 级：病斑面积占整个叶面积＞20%～30%；
5 级：病斑面积占整个叶面积＞30%～40%；
7 级：病斑面积占整个叶面积＞40%～50%；
9 级：病斑面积占整个叶面积＞50%。
式中：Ni为各级病叶数；
Gi为该药害对应级数；
NT为调查总叶数；
DITA为处理区防治后病情指数；
DITB为处理区防治前病情指数；
DICA为对照区防治后病情指数；
DICB为对照区防治前病情指数。
1.3 数据分析
试验数据采用Excel 2010 整理和绘制图表，统计分析运用SPSS 21.0 软件进行。
2.1 TraT2A 抑菌活性的测定
结果 (表1) 表明：不同浓度的TraT2A 对百合叶斑病原菌A. alternata均有不同程度的抑制作用，其中200.00 mg/mL 处理的抑菌作用最高，抑制率为72.12%，而66.67 mg/mL 处理的抑菌作用最差，抑制率为26.92%，两者之间差异达极显著水平 (P＜0.01)。
表1 TraT2A 对百合叶斑病菌的抑菌作用Table 1 The inhibition effect of TraT2A on A. alternata
2.2 TraT2A 抑菌条件的优化
2.2.1 紫外光照射时间对TraT2A 抑菌活性的影响
结果 (表2) 表明：随着紫外光照射时间延长，TraT2A 的抑菌活性逐渐降低，与TraT2A 对照及空白对照间差异均达极显著水平 (P＜0.01)。
表2 紫外光照射时间对TraT2A 抑菌活性的影响 (200.00 mg/mL)Table 2 The influence of UV irradiation time on the inhibition activity of TraT2A (200.00 mg/mL)
2.2.2 紫外保护剂对TraT2A 抑菌活性的影响 结果 (表3) 表明，同未加紫外保护剂照射30 min 的TraT2A 对照相比，两种紫外保护剂对TraT2A 活性都有保护作用，其中添加腐殖酸对TraT2A 的保护作用最高，抑制率为69.01%，比空白对照提高39.64%，但均略低于未经紫外照射的TraT2A 对照的抑制率。
表3 紫外保护剂对TraT2A 抑菌活性的影响 (200.00 mg/mL)Table 3 The influence of UV protective agents on the inhibition activity of TraT2A (200.00 mg/mL)
2.3 辅助剂对TraT2A 抑菌活性的影响
不同辅助剂对TraT2A 抑制百合叶斑病菌菌丝生长的活性均有影响：同种辅助剂浓度越大，TraT2A活性越高，抑菌作用越强，其中以0.17 mg/mL SP-4821A 处理的抑菌活性最好 (表4)。
表4 辅助剂对TraT2A 抑菌活性的影响 (200.00 mg/mL)Table 4 The influence of adjuvants on the inhibition activity of TraT2A (200.00 mg/mL)
2.4 TraT2A 与辅助剂混合液对百合叶斑病的田间防效
田间药效试验结果 (表5) 表明：随着防治次数增加，200.00 mg/mL TraT2A + 5.00 mg/mL 紫外保护剂腐殖酸 + 0.17 mg/mL 辅助剂SP-4821A 混合液对百合叶斑病的防治效果逐渐升高，并于第3 次施药后10 d 时达到最大，为80.37%，与单用TraT2A (防效为63.47%) 相比提高16.90%，差异达极显著水平 (P＜0.01)。
表5 TraT2A 与紫外保护剂、辅助剂混合液对百合叶斑病的田间防效Table 5 The field control efficacy of TraT2A + UV protective agents + adjuvants mixture for lily leaf spot
目前，国内生物农药剂型由于起步较晚还存在许多困难亟待解决，包括助剂种类过少、剂型单一、制剂开发及加工水平较低、制剂稳定性较低等问题[22-24]。辅助剂作为一种促进剂，可以包裹和携带农药有效成分在植物中进行跨膜转运，与其他药剂混配后可明显改善药剂的浸润和黏着性能，延长药液在靶标表面的持留时间，促进农药有效成分的吸收和传导，从而提高药效[25-27]。研究发现，深绿木霉T2 发酵液蛋白提取物TraT2A在低浓度时可以诱导兰州百合产生抗病性，诱导抗病效果可达55.89%，其防治百合灰霉病的持效期为7 d，并可提高百合叶片中相关防御酶的活性[28]；
当50% TraT2A 水分散粒剂的质量浓度分别为40 和20 mg/mL 时，其对百合灰霉病菌的抑制率及诱导抗病效果最高分别为61.79%和65.77%[29]；
20% TraT2A 诱导剂水剂在10 倍液时，对百合裂褶菌的诱导抗病效果为61.21%[30]。本研究发现，高浓度的TraT2A 对百合叶斑病菌具有较好的抑制作用，200.00 mg/mL 处理的抑制率为72.12%，将200 g TraT2A (质量浓度为200.00 mg/mL) + 5 g 腐殖酸 (质量浓度为5.00 mg/mL) + 0.17 g SP-4821A(质量浓度为0.17 mg/mL) + 794.83 mL 灭菌水的混合液，进行叶面喷施，可有效防治兰州百合叶斑病，田间防效为80.37%，与单用TraT2A 相比，其防治效果提高16.90%，表明在TraT2A 中加入紫外保护剂、辅助剂后可明显提高其活性和防治效果，这可能是因为紫外保护剂、辅助剂可减轻TraT2A 受紫外线等环境因素影响，减少了TraT2A降解，而辅助剂SP-4821A 作为全新结构的吸收传导促进剂增强了制剂稀释液在叶片表面的湿润性，促进了叶片对药剂的吸收，提高了TraT2A 进入植物体内的速度，从而提高药效。本研究仅分析了紫外光照射时间和辅助剂对TraT2A抑制兰州百合叶斑病菌活性及田间防治效果，而关于在TraT2A中添加紫外保护剂、辅助剂后制备的20% TraT2A制剂的质量标准、稳定性、货架期、防病持效期和大田防病效果等问题尚未涉及，有待进一步研究。