王 欢 王春又 梁高澎 张 恋 邓思思 张 静 邓向芬 翟志芳
陆军军医大学第一附属医院，重庆，400038
非结核性分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)，也称非典型分枝杆菌，是除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌种。NTM是环境腐生菌，对人类的致病性较低。皮肤和软组织的破坏往往是NTM从环境生态(土壤、天然水系统、工程水网络等)进入的门户。迄今为止，共发现NTM菌种190余种，14个亚种，NTM属条件致病菌，皮肤NTM感染的临床表现无特异性，而且病原体往往生长缓慢且难以培养，故往往被忽视或误诊。本研究回顾分析了我科诊治的皮肤NTM感染患者的临床、组织病理、病原学检测及治疗等相关资料并进行相关文献复习，现报道如下。
1.1 研究对象 收集2010年1月1日至2020年12月31日我科诊治的29例确诊为皮肤NTM感染患者临床资料。所有病例均为院外散发感染，诊断是基于临床、病理和微生物学证据的结合，其中19例患者为临床、病理及病原学联合确诊，其余10例患者为临床结合病理诊断。
1.2 研究方法
1.2.1 临床资料 回顾性分析皮肤NTM感染病例的性别、年龄、暴露因素、病程、临床表现、组织病理改变、病原学检查、治疗及转归。
1.2.2 组织病理及病原学检查方法 抗酸染色、PAS 染色(periodic acid-Schiff stain)、组织或脓液细菌培养、聚合酶链反应-反向斑点杂交法检测(PCR reverse dot blot，PCR-RDB)(亚能生物技术有限公司)、C-基因芯片杂交法、宏基因组学检测(metagenomicd next generation sequencing,mNGS)(微远基因有限公司)。
1.3 统计学方法 分析患者诊断、临床特征、病史、抗菌治疗、预后等资料，按不同类型的数、比值和平均值进行描述，采用卡方检验或Fisher精确检验对分类变量进行统计分析。P<0.05为有统计学差异。所有分析均采用SPSS 20.0统计软件进行。
2.1 一般资料 29例皮肤NTM感染患者中男10例(34%),女19例(66%)，男∶女约为1∶2；
男女发病率无显著性差异(χ2=2.793，P>0.05)。发病年龄14～87岁，平均(52.93±16.12)岁， 以40～59岁年龄段为主(15/29，52%)，不同年龄段患者发病率有显著差异，小于40岁的发病率明显低于40～59岁的(χ2=6.276，P<0.05)。23例患者为正常宿主，6例(21%)患者有不同的免疫抑制因素(包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎合并多发性肌炎、结缔组织病、多发性骨髓瘤、肾病综合征、葡萄膜炎)。结果见表1。
表1 29例皮肤NTM感染患者的临床特征 例(%)
2.2 临床特征 29例NTM感染患者从发病到明确诊断，病程2周～3年，平均病程6.9个月, 其中21例病程不超过6个月(表1)。快速生长型NTM(rapidly growing mycobacteria，RGM)较缓慢生长型(slowly growing mycobacteria，SGM)感染患者的病程短。29例患者中免疫功能正常和免疫抑制患者RGM与SGM感染率无显著差异(P>0.05)。RGM感染者9例(包括偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌)，SGM感染者10例(包括戈登分枝杆菌、海分枝杆菌、鸟分枝杆菌)(图1)。RGM感染患者中由于美容注射或针刺注射因素诱发的共4例(44.4%，4/9)，1例耻垢分枝杆菌感染者为打碎的花瓶划伤后出现。而SGM感染患者中大多数诱因不详，其中1例播散性胞内鸟分枝杆菌感染者有车祸外伤史和局部反复搔抓破损史。10例由组织病理诊断患者中4例分别为三角梅刺伤、鱼刺伤、修脚伤及溶脂术后导致，其余诱因不详。
图1 19例有病原学诊断病例分布图
本研究中NTM感染皮损主要以结节为主(19例)，其中伴溃疡者7例，病变单发者18例，多发者11例，以四肢的创伤部位为主(表1)。虽有6例患者存在免疫抑制因素，但均表现为较孤立性红斑结节，不伴全身症状。2例不伴免疫抑制因素患者出现严重的全身症状，其中一例为胞内鸟分枝杆菌感染患者，病程中反复高热、寒战症状，白细胞显著升高，但无器官损害，经治疗3个月好转后再次复发，调整方案并持续治疗9个月后治愈未复发。另1例播散性偶发分枝杆菌感染无基础疾病或免疫异常的患者出现高热、重度血小板减少及肺部感染，最后由于多器官衰竭而死亡。
2.3 组织病理学及病原学检查 17例患者表现为肉芽肿性炎症，伴有不同程度的组织坏死，5例为化脓性炎，6例表现为浅(深)层血管周围淋巴细胞和组织细胞浸润，1例表现为表皮假上皮瘤样增生伴真皮非特异性炎症浸润。菌种鉴定方法以mNGS4例阳性(4/4，100%)，PCR-RDB13例阳性(13/15，86.7%)；
C-基因芯片杂交法1例阳性(1/5，20%)。组织培养1例阳性(1/12，8%)。有25例患者PAS染色且均为阴性，抗酸染色阳性者17例(17/25，68%)，其中6例通过PCR-RDB明确菌种(表2)。对29例患者所采用的检测方法进行比较，结果显示mNGS阳性率最高(4/4，100%)，其次为PCR-RDB(13/15，86.7%)，C-基因芯片杂交法1例阳性(1/5，20%)，组织培养阳性率最低(1/12，8%)。
表2 19例明确病原体的NTM患者病原学检测及治疗结果
2.4 治疗及预后 29例皮肤NTM感染患者中，15例临床治愈(51.7%)，4例好转(13.8%)，3例无效(1例死亡)，7例失访，总有效率65.5%，其中2列联合手术切除清创治疗，治疗时间3个月～1年。3例偶发分支杆菌中1例口服盐酸米诺环素100 mg每日两次持续3个月治愈。2例脓肿分枝杆菌中1例采用克拉霉素和利奈唑胺联合，1例采用盐酸莫西沙星和盐酸米诺环素联合抗菌治疗持续3个月治愈。1例耻垢分枝杆菌采用异烟肼、利福平治愈。1例免疫原分枝杆菌采用克拉霉素加盐酸米诺环素联合治愈。1例海分枝杆菌单用盐酸米诺环素治愈。1例戈登分枝杆菌单用盐酸米诺环素无效，后调整为异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺加莫西沙星联合治愈。1例播散型胞内鸟分枝杆菌患者初始阶段采用利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、复方磺胺甲噁唑、阿米卡星联合治疗3个月后复发，调整为盐酸米诺环素、克拉霉素、阿米卡星、盐酸莫西沙星联合治疗15天好转，改为阿米卡星、盐酸莫西沙星、克拉霉素联合治疗1个月，最后盐酸莫西沙星联合克拉霉素持续6个月消退未复发。其余10例未明确菌种患者中6例单用盐酸米诺环素3～6个月治愈。
我国尚无大样本皮肤NTM病的流行病学调查资料，各地区发病率显示呈上升趋势[1]，这可能与免疫抑制剂、生物制剂的广泛使用、美容注射手术、人口老龄化和检测方法改进有关。常见引起皮肤病变的 NTM 主要有偶发分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、海分枝杆菌及溃疡分枝杆菌等。我们的研究中偶发分枝杆菌感染最常见，其次是戈登分枝杆菌和海分枝杆菌，与文献报告稍有不同[2-4]。本研究男女发病率无显著性差异，以40～59岁年龄段为主，平均病程6.9个月，主要发生在免疫力正常的个体，而且两例严重的播散性患者均具有正常免疫力，6例免疫抑制患者均表现为局限型损害，并未出现播散或全身症状。一方面可能病例数有限，另一方面反映了NTM感染后为一种缓慢过程，尤其SGM感染。Wentworth等[5]报道皮肤NTM 感染最常见的诱因包括外伤(76%)、美容操作(14%)及外科手术(10% )。本研究13例具有明确外伤史(44.8%)，6例由于微创美容注射、整形、吸脂手术等导致，占总数的20.7%，远高于文献报道，主要为RGM，以脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌多见，其发生原因与国内学者报道相似[6,7]，使用不合格产品或不规范操作可能是感染风险增加的原因，值得临床重视。国内学者对海分枝杆菌感染患者文章总结发现在我国海分枝杆菌诱因职业主要是渔民、水产养殖销售、厨师或家庭主妇[8]，这对我们寻找诱因建立诊断时非常重要的线索。
皮肤NTM皮损表现形态多样，早期为急性炎症反应和渗出，随后可见硬结、脓肿和窦道形成。本研究以结节和溃疡最多见，且皮损以单发为主(62%)，其他还包括脓肿、斑块、红斑，皮损无特异性，需要与皮肤结核、结节病、麻风、皮肤真菌病、奴卡菌病等鉴别。播散性NTM是免疫缺陷的一种表现，包括获得性的如HIV或医源性的，以及IFN-γ/IL-12通路基因缺陷引起[9]。引起播散性NTM的主要菌种有鸟-胞内分枝杆菌复合菌组、脓肿分枝杆菌、嗜血分枝杆菌等，次要菌种有偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、海分枝杆菌等。本研究中2例播散性患者中1例偶分枝杆菌感染，另1例为胞内鸟分枝杆菌感染，均无免疫缺陷的证据，此类情况临床上较为少见。由于播散性NTM潜在致命危险，因此尽早明确诊断及治疗。
皮肤NTM感染诊断手段非常重要，病原学检测方法包括组织病理、培养、基因芯片检查、PCR检测及宏基因组学。皮肤NTM感染患者的组织病理学是非特异性的，易被误诊为真菌或普通细菌感染，也不能完全与各种形式的皮肤结核完全区分。中性粒细胞浸润、间质性肉芽肿和小血管增生、抗酸染色阳性在非结核分枝杆菌感染中更为常见，而巨细胞、浆细胞、结核性肉芽肿和坏死在结核中更常见[10]。Song等[11]研究证实了小血管增生的存在可能是非结核分枝杆菌感染的重要诊断线索，这可能对结核和非结核分枝杆菌感染的鉴别诊断有价值。通常，组织病理检查被认为是NTM检测灵敏度较低的一种方法，组织抗酸染色虽然提高了NTM的阳性率，有助于早期诊断，但单独依据抗酸染色检查不能鉴别结核分枝杆菌和NTM，且不能明确NTM菌种。培养仍是检测NTM的最灵敏技术之一，指南[1]推荐病变组织和分泌物联合培养可提高培养的阳性率，RGM液体培养的阳性率更高。然而，多数NTM培养生长缓慢(一般6～8周)，往往延误治疗。本研究发现采用PCR-RBD检测NTM具有简便、快速(1 d)和阳性率高的优势，与既往学者研究报道一致[12]。近年来国内外NTM检测方法包括PCR-核酸序列检测法、PCR-限制性片段长度多态性( PCR-RFLP) 分析法及免疫学鉴定法等也都显示出极大优势[13]。而直接同源基因或序列比较方法则是当前菌种鉴定的“金标准”，以二代测序技术分辨率是目前最高的[1]，而且快速(6～7 d，平均48 h)。尽管本研究显示mNGS、PCR-RDB在NTM感染检测中具有较高的阳性率，由于总体上样本量小，尚无法比较各种检测方法在灵敏度、特异性等方面的优劣。但是2020年《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》[14]已明确推荐对于临床疑似局灶性(如皮肤软组织、关节腔、尿路、眼部)感染，将mNGS作为培养或PCR之外的二线首选手段，对于新发、罕见、疑难感染性疾病以及免疫缺陷患者，则可作为一线检测手段，足以显示mNGS在NTM感染诊断中的重要地位。此外，虽然本研究中少数采用蜡块标本进行mNGS检测均为阳性，但是考虑到蜡块中的病原体不易被裂解，提取核酸效率低，且时间长的蜡块内病原体DNA可能已被降解，蜡块PCR或qPCR的检出率不如新鲜组织或培养产物的因素[15]，笔者认为早期选取新鲜标本，同时选择PCR或mNGS等检测有助于尽早鉴定菌种、明确诊断和及时治疗。由于单个标本的阳性率相对较低，还特别建议收集多个新鲜标本检测为宜。
由于不同NTM用药种类和疗程有所不同，指南[1]不建议对疑似NTM病进行试验性治疗。但在临床工作中，常常受到多种条件限制，往往无法明确NTM的具体菌种。因此在治疗药物选择方面，常会面临两种处境：一是能够明确病原菌，参照指南[1]择药物及联用方案；
二是未明确病原菌的临床诊断患者，参照指南进行经验性治疗。我们研究中病原菌明确且治愈的患者治疗方案与2020年指南推荐一致，对于皮损多发及播散性病例方案可能需要定期随访调整，甚至联合外科手术清创才能获得成功。大多数NTM对克拉霉素、米诺环素是敏感的，这可能是本研究中抗酸染色均为阳性但未能明确菌种的6例患者单用盐酸米诺环素即能治愈的原因，当然也可能与皮损多为单发，病情较轻相关。结合我们及其他学者的研究总结[7,15]，我们建议至少2种抗生素联用，且至少含1种大环内酯药物，疗程4个月或更长，以确保疗效和避免复发，同时联合手术清创以尽早获得成功治疗。
综上，本研究由于病例数量相对较少，同时部分临床资料不够完善，如诱因的追溯等，导致本研究在不同分枝杆菌感染自然病程、诱发因素、临床表现方面有一定局限性，需要累积更多临床病例进行总结分析，以给临床医生提供更多的临床借鉴。
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