刘立春，张立胜，张秋文，刘素媛，张新杰
据流行病学统计，目前感染性角膜炎已成为我国角膜盲的首要诱因，其中真菌性角膜炎(FK)发病率呈逐年上升趋势，部分地区发病率已跃居感染性角膜炎的首位，分析与糖尿病等全身慢性疾病增多以及抗生素、免疫抑制剂、糖皮质激素的广泛使用等有关[1]。FK主要由致病真菌引起，其病原体可通过释放大量基质金属蛋白酶和蛋白水解酶刺激角膜基质胶原纤维，诱导角膜溃疡，而菌体抗原特性可引发角膜炎症反应，单纯抗真菌药物治疗难以将患者炎症反应彻底消除[2]。因此，探究FK病原学特点及药物耐药性，对了解该病发病机制及选择合适治疗药物至关重要。现临床已发现百余种真菌可诱发角膜感染，而地域、气候、发病诱因等多种因素均会影响此类病原菌分布，导致各地区FK患者病原菌分布差异明显[3]。目前链格孢菌、镰刀菌、曲霉菌是我国FK患者的主要病原体，我国不同病原体中交替的链格孢菌感染人数呈逐年上升趋势，但其所致特异性机制现尚未明确[4]。研究显示，链格孢菌对大部分抗逆转录病毒药物较为敏感，所致角膜溃疡症状较轻，施以有效的抗菌药物后通常预后较好[5]。然而，目前临床多侧重于分析FK致病菌种类及药物敏感性，尚无系统性研究报道病原菌属与FK患者预后的关系。因此，本研究就不同病原菌属与FK患者预后的关系进行分析，以期为临床治疗该病提供新思路，现报告如下。
1.1一般资料 选取2018年1月—2019年12月我院收治的FK 120例(120只眼)为研究对象。纳入标准：符合《感染性角膜病临床诊疗专家共识(2011年)》[6]中的FK诊断标准，角膜刮片培养、角膜共聚焦显微镜检查和裂隙灯显微镜检查均提示FK，真菌培养阳性；
无抗真菌药物治疗史；
自愿签署相关知情同意书。排除标准：角膜穿通伤者；
细菌感染或棘阿米巴感染者；
全身性多重感染或严重感染者；
恶性肿瘤者；
精神障碍者；
有眼底病变者；
有角膜移植手术史者；
因肝肾功能不全或药物过敏等原因无法行药物治疗者；
治疗依从性较差者；
不能按时随访者。根据感染病原菌属将FK 120例分为A组(病原菌属为链格孢属)20例、B组(病原菌属为曲霉菌属)28例、C组(病原菌属为镰刀菌属)57例和D组(病原菌属为其他菌属)15例。4组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。
表1 4组真菌性角膜炎患者一般资料比较
1.2病原菌培养与鉴定方法 采用奥布卡因(山东博士伦福瑞达制药有限公司，国药准字H20051411)4 g/L行角膜表面麻醉，在角膜溃疡病灶边缘留取病灶刮取标本并接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(上海圻明生物科技有限公司)，置于相对湿度40%、温度28 ℃下的恒温恒湿培养箱(姜堰市新康医疗器械有限公司)中培养3～10 d，后分离阳性标本中菌落至马铃薯葡萄糖琼脂培养基平皿(上海圻明生物科技有限公司)。丝状真菌菌落采取小培养法种属鉴定，以小培养后光镜下发现菌丝和孢子特征、肉眼菌落特征为鉴定依据；
酵母样真菌采用生化反应鉴定法，利用法国生物梅里埃公司API 20C AUX酵母菌鉴定试剂盒鉴定。
1.3抗真菌药物敏感试验方法 选择Rosco纸片扩散法行抗真菌药物敏感试验。挑取真菌菌落置于生理盐水中并制成均匀菌液(麦氏浊度0.5～1.0)。后将菌液均匀涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平皿，贴上Neo-Sensitab抗真菌药物敏感试验纸片(丹麦ROSCO公司)后检测。以伊曲康唑、氟康唑、那他霉素、两性霉素B为试验药物。在相对湿度40%、温度28 ℃环境下培养24～48 h后行抑菌环(真菌生长被完全抑制的环形区域)直径测量，按照直径大小判定耐药、中介或敏感，具体判定标准[7]见表2。
表2 不同抗真菌药物敏感试验判定标准
1.4治疗方法 入院后所有患者给予那他霉素滴眼液(北京银建药业有限公司，国药准字H20083650)滴眼，每次1滴，每小时1次；
伊曲康唑胶囊(成都倍特药业有限公司，国药准字H20010767)0.2 g每日1次口服。待抗真菌药物敏感试验结果出来后按照患者具体情况调整用药。药物疗效欠佳时根据具体情况行手术治疗，中央和旁中央中浅层角膜溃疡者给予板层角膜移植术，旁中央浅层角膜溃疡者给予病灶切除联合羊膜移植术，周边中浅层角膜溃疡者给予病灶切除联合结膜瓣覆盖术，角膜溃疡穿孔或后弹力层膨出者给予穿透性角膜移植术，近全角膜或全角膜脓性溃疡并伴有严重并发症者给予眼内容物剜除术。
1.5观察指标 ①观察FK患者病原菌属分布情况。②分析FK患者主要病原菌属对药物的耐药率。③探讨不同病原菌属与FK患者预后的关系。按照治疗方式将FK患者预后分为4个等级，Ⅰ级为药物治愈，Ⅱ级为采用板层角膜移植术、病灶切除联合羊膜移植术、病灶切除联合结膜瓣覆盖术治疗，Ⅲ级为采用穿透性角膜移植术治疗，Ⅳ级为采用眼内容物剜除术治疗。④比较4组药物治愈患者用药时间和停药后4周患眼最佳矫正视力。药物治疗后角膜溃疡处愈合，角膜共聚焦显微镜检查示无真菌菌丝，停药后4周内无复发，即为药物治愈[8]。
2.1病原菌属分布情况 120例FK共培养出127株真菌，其中镰刀菌属最多占44.88%，其次为曲霉菌属(25.98%)、链格孢属(15.75%)。见表3。
表3 真菌性角膜炎患者病原菌属分布情况
2.2主要病原菌属药物耐药率分析 链格孢属、曲霉菌属、镰刀菌属对氟康唑和伊曲康唑耐药率均较高，对那他霉素和两性霉素B耐药率均较低。见表4。
表4 真菌性角膜炎患者主要病原菌属药物耐药率分析
2.3不同病原菌属与FK患者预后关系 B、C组预后水平较A、D组差(P<0.05)，B、C组之间和A、D组之间预后水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。
表5 不同病原菌属与FK患者预后的关系[例(%)]
2.44组药物治愈患者用药时间和停药后4周患眼最佳矫正视力比较 药物治愈患者用药时间C组明显长于A、B、D组(P<0.05)，A、B、D组比较差异无统计学意义(P>0.05)；
药物治愈患者停药后4周患眼最佳矫正视力A组高于B、C、D组(P<0.05)，B、C、D组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。
表6 4组药物治愈FK患者用药时间和停药后4周患眼最佳矫正视力比较
FK是一种致盲率极高的感染性角膜病，若角膜炎症无法控制，极有可能出现角膜穿孔，甚至发生眼内容物脱出、继发性眼内炎等严重并发症而必须行眼球摘除术或眼内容物剜除术[9]。而FK致病菌属繁多，菌谱随地域、时间变化也会发生改变，并且不同病原菌属毒力各异，对抗真菌药物的敏感性也不尽相同，患者临床表现差异明显，如链格孢属感染者临床体征较轻，曲霉菌属、镰刀菌属感染者临床体征较为严重[10-11]。尽管目前临床上分析FK病原学特点及药物敏感性的报道较多，但是不同病原菌属与FK患者预后的关系相关研究较少，故本研究对此进行初步探讨。
本研究结果显示，120例FK共培养出127株真菌，其中镰刀菌属最多占44.88%，其次为曲霉菌属占25.98%、链格孢属占15.75%，这一结论与TANANUVAT等[12]报道相似。张阳等[13]报道我国FK患者病原菌属以镰刀菌属为主，其次为曲霉菌属和链格孢属，支持本研究结论。闻兴慧[14]也发现镰刀菌属是我国FK患者首要致病菌，其次为曲霉菌属，与本研究结果相似。但胡卫萍等[15]认为我国FK患者曲霉菌属占比高于镰刀菌属和链格孢属，与本研究结论不一致，推测与FK病原菌属分布存在显著地域性差异有关。本研究FK患者中链格孢属感染占比也较高，推测与本研究入选患者中从事户外农业生产人员较多有关。由于此类患者容易出现直接植物性外伤，诱发链格孢属感染，故从事户外农业生产者应强化眼部保护，以降低植物性外伤所致FK发生率。此外，本研究结果显示，链格孢属、曲霉菌属、镰刀菌属对氟康唑和伊曲康唑的耐药率均较高，对那他霉素和两性霉素B的耐药率均较低，与CHONGKAE等[16]报道结论吻合。提示不同病原菌属FK患者对抗真菌药物的敏感性存在差异，临床应根据药物敏感试验结果给予针对性抗菌药物治疗。分析上述致病菌对氟康唑的耐药率均较高的原因，可能与氟康唑对临床眼科常见病原菌天然耐药有关。
本研究结果显示，B、C组预后水平较A、D组差，提示不同病原菌属会影响FK患者预后。曲霉菌属感染通过释放毒素、机械性损伤等机制可引发角膜组织损伤，并且可通过产生降解胶原纤维的酶类溶解并破坏角膜组织，释放抑制机体免疫物质，逃避机体免疫杀伤，故此类患者预后不理想。镰刀菌属感染同样可通过释放毒素与直接机械性损伤引发角膜组织破坏，同时入侵到角膜组织的菌丝还可能诱发菌丝细胞壁增厚、菌丝内套菌丝情况，致使致病力和耐药性增强，故临床治疗颇为棘手。而链格孢属致病力较低，对角膜毒力轻微，所致角膜溃疡症状较轻，通常药物治疗效果颇为理想。但王璐璐等[17]认为曲霉菌属所致FK患者预后最差，与本研究结论存在偏倚，推测与预后水平分级不同有关。
本研究结果显示，药物治愈患者用药时间C组明显长于A、B、D组，推测可能是镰刀菌属感染出现菌丝细胞壁增厚情况，使得其具有较强的耐药性，而那他霉素滴眼液存在水溶性较差、角膜通透性偏低等缺陷，故该类患者用药时间明显延长。有研究指出，镰刀菌属所致FK患者病情进展迅速，可出现大面积侵袭感染，这可能也是造成FK患者用药时间延长的重要原因[18]。此外，本研究结果还显示，药物治愈患者停药后4周患眼最佳矫正视力A组高于B、C、D组，与CHIDAMBARAM等[19]报道结论相似。推测原因为链格孢属感染多致浅表角膜溃疡，通常药物疗效较好，并且溃疡愈合后形成的角膜云翳通常较淡，有助于患者视力恢复。刘欣等[20]也发现链格孢属所致FK患者临床体征较轻，一般药物治疗效果较好。
综上，链格孢属、曲霉菌属、镰刀菌属是FK患者三大常见病原菌属，对那他霉素和两性霉素B耐药率均较低，其中曲霉菌属和镰刀菌属感染FK患者预后较差，临床应根据药物敏感试验结果给予针对性抗菌药物治疗。但本研究也存在一些不足，如纳入研究的FK患者例数偏少，未分析感染严重程度与病原菌属分布特点之间的关系，这可能对研究结论的普适性有一定影响；
对不同病原菌属与FK患者预后相关的具体原因未能明确，有待今后深入研究。