雷昌，凌成利，黄丹，邹蔓姝，赵洪庆，张秀丽，刘建军，苏捷，王宇红，向韵
1.湖南中医药大学科技创新中心，中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208；
2.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410208
抑郁症是危害人类身心健康的常见情感障碍疾病，严重者有自杀倾向，已成为全球疾病负担的主要原因。其发病机制尚不明确，西医治疗存在效果欠佳、复发率较高、不良反应大等问题。中医治疗抑郁症能缓解症状，且具有标本兼治、不良反应少、不易复发等优势，逐渐受到国内外学者重视。
人参味甘、微苦，有补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、益心智功效；
贯叶金丝桃味辛、性寒，入肝经，具有疏肝解郁、清热利湿功效。两药是常用的抗抑郁中药，但目前尚未见有关两药配伍抗抑郁作用的研究。基于此，本研究以抑郁症模型大鼠为研究对象，采用基线等比增减设计法观察人参、贯叶金丝桃不同配比对模型大鼠行为学，血清细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），下丘脑-垂体-肾上腺轴指标促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质酮（CORT）含量的影响，优选两者发挥抗抑郁作用的最佳配比，并测定最佳配比组大鼠海马组织糖皮质激素受体（GR）、血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1（SGK1）蛋白表达，探讨人参、贯叶金丝桃配伍抗抑郁的可能机制，为两药配伍抗抑郁的实验研究及药物开发提供新思路。
1.1 动物
SPF级健康雄性SD大鼠80只，体质量200～250 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于湖南中医药大学SPF级动物实验中心，相对湿度（50±5）%，温度（25±2）℃，光暗交替周期12 h。
1.2 药物
人参、贯叶金丝桃饮片，购于湖南中医药大学附属第一医院，并经湖南中医药大学科技创新中心黄丹老师鉴定，人参为五加科植物人参C.AMey的干燥根和根茎，贯叶金丝桃为藤黄科植物贯叶金丝桃L.的干燥地上部分。盐酸氟西汀胶囊，礼来苏州制药有限公司，批号0722A，20 mg/粒，将1粒胶囊内容物溶于37 mL蒸馏水中，4℃低温保存备用。
1.3 主要试剂与仪器
IL-6、TNF-α、ACTH、CORT ELISA试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司，货号分别为210317R05、210317R11、210423R09、210422R07），GR、SGK1抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号分别为24050-1-AP、28454-1-AP），protein marker（美 国Thermo，货号26616），Tris（德国BioFroxx，货号115KG001-1KG），BCA蛋白定量试剂盒（安徽biosharp，货号69107317），RAPI裂解液（北京索莱宝，批号01408/35020），HRP-山羊抗兔IgG（美国Proteintech，货号20000373）。旋转蒸发仪（德国Heidolph），open field敞箱（成都泰盟公司），Morris水迷宫（北京智鼠多宝生物科技公司），AL204电子分析天平（德国梅特勒托利多），5804R离心机（德国Eppendorf公司），Varioskan Flash多功能酶标仪（美国热电），蛋白电泳转膜系统（北京六一），Qption-Q超纯水仪（英国ELGALabWaters）。
2.1 药物及制备
2020年版《中华人民共和国药典》人参用量3～9 g、贯叶金丝桃用量2～3 g，取成人临床常用量，人参9 g、贯叶金丝桃3 g，二者配伍用量12 g，换算成大鼠等效剂量为1.3 g/kg（人参0.975 g/kg、贯叶金丝桃0.325 g/kg）。
按不同配比称取药物饮片，用60%乙醇回流提取2次，第1次加8倍量提取2 h，第2次加6倍量提取1 h，合并2次提取液，过滤（300目筛），回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.20～1.25稠膏。药渣加水煎煮2次，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，合并2次滤液，减压浓缩至相对密度为1.20～1.25稠膏，与上述稠膏合并，混匀，60～65℃真空干燥，使用时配制成人参、贯叶金丝桃不同配比的总浓度为0.13 g/mL溶液。
2.2 分组与给药
采用基线等比增减设计法，根据前期基础，以人参-贯叶金丝桃5∶1作为配比基线，人参和贯叶金丝桃用量以16.6%向两侧递增或递减，分别设置人参-贯叶金丝桃5∶1组（人参1.08 g/kg+贯叶金丝桃0.22 g/kg）、人参-贯叶金丝桃2∶1组（人参0.87 g/kg+贯叶金丝桃0.43 g/kg）、人参-贯叶金丝桃1∶1组（人参0.65 g/kg+贯叶金丝桃0.65 g/kg）、人参-贯叶金丝桃1∶2组（人参0.43 g/kg+贯叶金丝桃0.87 g/kg）、人参-贯叶金丝桃1∶5组（人参0.22 g/kg+贯叶金丝桃1.08 g/kg），另设人参组（0.975 g/kg）、贯叶金丝桃组（0.325 g/kg）、阳性药组（5.4 mg/kg）、模型组和空白组，每组8只。造模同时灌胃给药，各中药组按相应配比称取饮片，按“2.1”项下方法制备后灌胃，阳性药组灌胃盐酸氟西汀溶液，空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水。灌胃体积10 mL/kg，每日1次，连续28 d。
2.3 造模
采用慢性不可预知性温和应激法建立抑郁症大鼠模型，应激方式包括4℃冷水浴3 min、热水浴（40～42℃）3 min、噪音8 h、夹尾1 min、45°倾笼24 h、昼夜颠倒24 h，每日随机采用1种刺激，且同一种刺激不连续出现，造模期间动物均单笼饲养。空白组正常饲养，不予任何刺激，连续28 d。
2.4 行为学检测
2.4.1 旷场实验
末次给药1 h后，采用底部和四壁均为黑色的敞箱（80 cm×80 cm×40 cm），底部用白线划分成5×5个方格，观察并记录大鼠在3 min内水平穿越底面方格次数及垂直活动次数（双足离开地面至双足放下计为1次）。
2.4.2 水迷宫实验
从第23日开始进行Morris水迷宫实验，将水迷宫分为A、B、C、D共4个象限，在A象限放置一平台，加水没过平台2 cm，将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠自由爬上平台的时间，即逃避潜伏期，若90 s内仍未爬上平台，引导其至平台上并停留15 s，此时逃避潜伏期为90 s，连续测量5 d。第28日移走平台，将大鼠放入水中，观察其30 s内活动情况，记录其在A象限停留的时间，即目标象限停留时间。
2.5 ELISA检测
干预结束后，大鼠禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛腹腔注射（4 mL/kg）麻醉，仰卧于手术台上，剪开腹腔，腹主动脉采血，静置2 h，4℃、3000 r/min离心15 min，将血清转移至1.5 mL离心管备用。ELISA检测IL-6、TNF-α、CORT、ACTH含量，按照试剂盒说明书操作。
2.6 Western blot检测
脱颈处死大鼠，断头取脑，冰盒上迅速剥离海马并称重，按每1 mg海马组织加入4 μL裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），于冰上匀浆，4℃、12000 r/min离心15 min，取上清液，BCA法检测蛋白含量，上清液加入1/4体积loading buffer混匀，95℃加热5～10 min使蛋白变性。取各组蛋白样品上样，凝胶电泳，湿法转至硝酸纤维素膜上，以脱脂牛奶室温封闭2 h，滴加GR一抗（1∶2000）、SGK1一抗（1∶1000）、β-actin一抗（1∶20000），4℃孵育过夜，PBST清洗3次，加入相应二抗（1∶15000），室温孵育2 h，PBST清洗3次。采用ECL化学发光法曝光，AlphaEaseFC软件进行分析，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值计算目的蛋白相对表达量。
4.1 人参-贯叶金丝桃不同配比对模型大鼠行为学的影响
与空白组比较，模型组大鼠旷场实验水平穿格次数和垂直活动次数明显减少，差异有统计学意义（＜0.01）；
与模型组比较，各给药组大鼠旷场实验水平穿格次数和垂直活动次数均明显增加，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01），其中人参-贯叶金丝桃1∶1组作用最明显，与其他配比组比较差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。结果见表1。
表1 各组大鼠旷场实验水平穿格次数、垂直活动次数比较（±s）
与空白组比较，模型组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期明显延长（＜0.01），目标象限停留时间明显缩短（＜0.01）；
与模型组比较，各给药组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期明显缩短（＜0.05，＜0.01），除人参-贯叶金丝桃1∶5组外，其余各组大鼠目标象限停留时间明显延长（＜0.05，＜0.01），其中人参-贯叶金丝桃1∶1组作用最明显，与其他配比组比较差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。见表2。
表2 各组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期、目标象限停留时间比较（±s，s）
4.2 人参-贯叶金丝桃不同配比对模型大鼠血清白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、促肾上腺皮质激素、皮质酮含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠血清IL-6、TNF-α、ACTH、CORT含量明显增加（＜0.01）；
与模型组比较，人参组、贯叶金丝桃组、人参-贯叶金丝桃2∶1、1∶1组大鼠血清TNF-α、IL-6含量明显减少（＜0.05，＜0.01），人参-贯叶金丝桃2∶1、1∶1、1∶2组大鼠血清CORT、ACTH含量明显减少（＜0.05，＜0.01），其中人参-贯叶金丝桃1∶1组作用最明显，与其他配比组比较差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。见表3。
表3 各组大鼠血清IL-6、TNF-α、ACTH、CORT含量比较（±s，ng/mL）
4.3 人参-贯叶金丝桃最优配比对模型大鼠海马组织糖皮质激素受体、血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1蛋白表达的影响
为明确人参-贯叶金丝桃最佳配比抗抑郁的作用机制，采用Western blot检测空白组、模型组、人参组、贯叶金丝桃组、人参-贯叶金丝桃1∶1组（最佳配比组）大鼠海马组织GR、SGK1蛋白表达。结果显示，与空白组比较，模型组大鼠海马组织GR蛋白表达明显降低，SGK1蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）；
与模型组比较，贯叶金丝桃组、最佳配比组大鼠海马组织GR蛋白表达明显升高（＜0.01），人参组、贯叶金丝桃组、最佳配比组大鼠海马组织SGK1蛋白表达明显降低（＜0.01）。结果见表4、图1。
表4 各组大鼠海马组织GR、SGK1蛋白表达比较（±s）
图1 各组大鼠海马组织GR、SGK1蛋白免疫印迹
抑郁症属中医学“郁证”范畴，病始在肝，累及心神，与脑相关，气血失调是其关键病机。肝主疏泄，调畅气机，与气血运行关系密切。肝主情志，若情志不遂，气机失调，气血运行受阻，气滞血瘀，瘀血内阻，神明不能内守，则见心悸、失眠、健忘、性情急躁。因此，治宜疏肝解郁、活络安神。本课题组针对郁证病机研发抗抑郁中药复方百事乐胶囊，前期研究显示，其可提高皮质酮暴露下海马神经元细胞活力，促进神经细胞可塑性，缓解模型大鼠抑郁样行为，通过调控海马PI3K信号通路关键因子发挥抗抑郁功效，且对肝郁气滞型抑郁症患者疗效确切。该方由人参、贯叶金丝桃、姜黄组成，具有理气活血、宁心安神功效。方中人参大补元气、安神益智；
贯叶金丝桃疏肝解郁，取散诸结之意；
姜黄活血化瘀、行气止痛，善破肝脾二经之血瘀气结，主血瘀气滞诸证。前期拆方研究发现，人参与贯叶金丝桃配伍有良好的抗抑郁作用。人参作为常用补气中药，其抗抑郁作用成为近年研究热点。贯叶金丝桃是常用抗抑郁中药，其提取物对轻、中度抑郁症疗效好，且不良反应小。因此，研究人参、贯叶金丝桃最佳配比能提高治疗抑郁症效果，最大程度发挥中药功效。
基线等比增减设计法适用于效应明确的中药小复方（或药对）配比优化，该方法不仅能较好地分析药物在不同剂量配比下效应的区别，还能极大地减少实验次数与成本。本研究以人参、贯叶金丝桃在百事乐胶囊中的配比5∶1为基线，两药用量以16.6%向两侧递增或递减确定不同配比，行为学实验和ELISA检测结果表明，人参-贯叶金丝桃在一定范围内配比能够明显提高模型大鼠活动次数和学习记忆能力，改善抑郁样行为，降低血清IL-6、TNF-α、ACTH、CORT含量，其中以人参-贯叶金丝桃1∶1配比效果最佳，优于其他配比组及人参、贯叶金丝桃单味药组。课题组研究发现，百事乐胶囊主要化学成分为黄酮类、皂苷类、有机酸类、萜类和姜黄素类。而有研究表明，抗抑郁药物活性成分主要集中在黄酮类、皂苷类、酚酸和挥发油类。提示人参与贯叶金丝桃主要有效成分，如皂苷类、黄酮类和酚酸类成分产生了协同作用，且配伍可能增强二者抗抑郁作用。
抑郁症机制尚未阐明，其研究假说主要有单胺递质假说、第二信使失衡假说、受体假说等，上述假说均与海马神经元再生障碍密切相关。SGK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与海马神经元再生密切相关。SGK1作为GR的下游靶基因，可通过糖皮质激素信号调节GR活性，亦可反馈调控p-GR水平及核转移。采用海马神经前体细胞联合GR、SGK1抑制剂发现，SGK1是CORT降低海马神经元再生的下游位点，并维持其上游GR的功能。有研究表明，SGK1不仅参与糖皮质激素诱导的人海马神经元细胞增殖和分化减少，并且在模型大鼠海马组织中表达升高，而SGK1表达升高与重度抑郁症致病性应激假说有关。本研究根据行为学实验和ELISA检测结果，对最佳配比组及人参、贯叶金丝桃单味药组大鼠海马组织GR、SGK1蛋白表达进行检测。结果显示，人参-贯叶金丝桃1∶1配比可降低大鼠海马组织SGK1蛋白表达，升高GR蛋白表达，推测两药配伍可能通过降低SGK1表达，调节GR功能，维持下丘脑-垂体-肾上腺轴平衡，从而发挥抗抑郁功效。然而抑郁症发病机制复杂，课题组后续将进一步验证人参-贯叶金丝桃的最佳配比，同时对两药配伍抗抑郁的作用机制进行深入研究。
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