朱张求，石孟瑶，方 莉，朱 洁，李泽庚，3，童佳兵，3
(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；
2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；
3.安徽省中医药科学院中医呼吸病防治研究所，安徽 合肥 230031)
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种可预防和治疗的慢性疾病，其主要特征为气流受限并呈进行性发展。COPD发病机制复杂，其中炎症机制是其主要的发病机制。慢性炎症导致中性粒细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等多种炎症细胞浸润在气道、肺实质及肺血管，炎症因子如白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8)与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)大量释放，引起肺组织的渗出、水肿及黏液高分泌，导致气道狭窄、痉挛及肺泡的通气功能障碍，最终引起肺功能下降。
芪白平肺胶囊是安徽中医药大学第一附属医院研发的具有温阳益气、化痰散瘀作用的院内制剂，多年临床研究证实该方能够显著改善COPD痰瘀阻肺证患者的炎症状态及肺功能，促进COPD的康复。为了进一步探究其作用机制，本研究观察芪白平肺胶囊对COPD痰瘀阻肺证模型大鼠的相关炎症因子表达水平及肺功能的影响。
1.1 动物 选用80只健康SPF级雄性SD大鼠，8周龄，体质量(230±20)g，由山东省动物实验动物中心(动物合格证号:SCXK 20190003)提供。将其随机分为正常组、模型组、脾氨肽组、芪白平肺胶囊组，每组20只。动物饲养于安徽中医药大学动物实验研究中心，动物饲养室为清洁级,控制温度在(22±2)℃。
1.2 药物与试剂 芪白平肺胶囊(由黄芪、生晒参、川芎、薤白、葶苈子、五味子、地龙组成),由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供，生产批号 20190805；
脾氨肽口服冻干粉，每瓶2 mg，由大连百利天华制药公司生产；
IL-1β ELISA试剂盒(批号 JYM0419Ra)、IL-6 ELISA试剂盒(批号 JYM0646Ra)、IL-8 ELISA试剂盒(批号 JYM0583Ra)、TNF-α ELISA试剂盒(批号 JYM0635Ra)均购自武汉基因美科技有限公司。
1.3 仪器 动物实验低氧装置：上海塔望科技有限公司；
2 m熏烟箱、大鼠强迫游泳槽：自制；
红梅牌香烟(焦油含量：13 mg；
烟碱含量：1.1 mg)：红塔卷烟集团；
RT-6000酶标仪：深圳雷杜生命科学股份公司；
JW3021HR离心机：安徽嘉文仪器装备有限公司；
GL-88B漩涡混合器：海门其林贝尔仪器制造公司；
DNP-9052BS-Ⅲ电热恒温箱：上海三发科学仪器有限公司；
RES3020小动物肺功能仪：北京贝兰博科技有限公司。
2.1 模型复制及给药 参照相关模型复制方法,每天将模型组、脾氨肽组及芪白平肺胶囊组大鼠放入恒温(43±1)℃水槽中强迫游泳30 min,使其劳累而耗伤肺气；
然后将大鼠置于2 m熏烟箱内被动吸烟,每天用20支去过滤嘴红梅牌香烟烟熏一次，每次0.4 h。最后将大鼠置于常压低氧并通入氮气的低氧箱内，每天低氧7 h，用自动测氧仪控制氧浓度为10.0%±0.5%，通过传感器将CO浓度维持在0.03%，温度传感器控制低氧箱内温度始终恒定在22～24 ℃。蒸气由变色硅胶(烘干后可反复使用)吸收。箱体由透明有机玻璃制造,可观察大鼠活动、进食、饮水等情况。每日模型复制结束后，正常组及模型组大鼠予以0.9%氯化钠溶液(10 mL/kg)灌胃，脾氨肽组每日将2瓶脾氨肽冻干粉(共4 mg)溶于100 mL 0.9%氯化钠溶液中，然后按10 mL/kg对大鼠进行灌胃，芪白平肺胶囊组每日将10粒芪白平肺胶囊(共4 g)溶于80 mL 0.9%氯化钠溶液中，煮沸冷却至室温后，然后按10 mL/kg对大鼠进行灌胃。连续复制模型1个月，每周一至周六复制模型，每周日喂食前将称量大鼠体质量。当大鼠肺功能数据明显降低，肺泡间隔明显增厚或融合，大量炎症细胞聚集在肺组织，即表明模型复制成功。
2.2 观测指标及方法
2.2.1 一般情况 观察大鼠的精神状态、毛发、活动、爪甲及唇舌颜色、有无异常呼吸音、体质量、进食量、大小便等。
2.2.2 肺功能检测 按2 mL/kg剂量腹腔注射1%戊巴比妥麻醉大鼠，于颈部正中切开皮肤，钝性剥离肌肉组织，暴露气管并切开，插入连接有三通开关的气管插管并结扎，仰卧位放置于密闭体积描计器内，通过肺功能仪记录第0.3秒用力呼气容积(forced expiratory volume in 0.3 seconds,FEV0.3)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、FEV0.3占FVC比值(FEV0.3/FVC)的数值。
2.2.3 血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平检测 末次给药后禁食12 h，从腹主动脉取血，采用酶联免疫吸附法检测血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达水平。
2.2.4 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的采集 从腹主动脉采血后，继续剪开大鼠颈部皮肤，并打开胸腔，剥离覆盖肺组织的胸腺和心包，找到气管分支，先结扎右主支气管，然后将9号小鼠灌胃针经左主支气管插入1 cm，并在灌胃针末端结扎，将4 ℃生理盐水5 mL经气管注入左主支气管及左肺，等待约30 s后，反复回抽3次，回抽液3～4 mL，回收率为65%～85%，将回收液置于5 mL离心管中，于4 ℃ 3 000 r/min离心20 min，吸取上清液，放置于2 mL冷冻管中，-80 ℃超低温冰箱保存。BALF离心后所得的细胞沉淀用1 mL灭菌的PBS重悬后，保存于2 mL冷冻管中，4 ℃冰箱中保存，用于细胞计数与分类计数。
2.2.5 肺组织病理检查 采集BALF后，分离右肺上叶，经生理盐水冲洗干净后，用滤纸吸干表面水分，然后置于4%甲醛固定48 h后进行石蜡包埋，切片，制片，最后进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察肺组织病理形态。
3.1 4组大鼠一般情况比较 模型复制结束后，正常组大鼠精神状态佳，呼吸平稳，毛发光泽，食量正常，体质量逐渐增加；
模型组大鼠精神状态较差，喜静恶动，毛发发黄欠光泽，呼吸音明显较重，呼吸急促，部分大鼠肺部可闻及痰鸣音，唇舌部及爪甲发绀，进食量减少，体质量明显减轻；
脾氨肽组及芪白平肺胶囊组大鼠精神状态佳，呼吸较平稳，无明显异常呼吸音，毛发光泽，体质量逐渐增加，其中芪白平肺胶囊组大鼠一般状态改善更为明显。
3.2 4组大鼠肺组织形态比较 正常组大鼠肺泡结构完整,肺泡充气状态良好,肺泡间隔无明显增厚，未见明显炎症细胞浸润。与正常组比较，模型组大鼠肺泡普遍局限性增大，肺泡间隔明显增厚或损坏，支气管壁可见明显黏液腺增生，大量炎症细胞聚集在肺实质和间质，同时可见部分肺泡萎缩塌陷，管腔变窄，符合COPD的病理改变。与模型组比较，脾氨肽组及芪白平肺胶囊组大鼠肺泡间隔大多正常，可见少量萎缩肺泡和融合肺泡，炎症细胞浸润明显减少，气管壁黏液腺增生明显改善，其中芪白平肺胶囊组大鼠肺组织病理变化改善更为明显。见图1。
注：A.正常组；
B.模型组；
C.脾氨肽组；
D.芪白平肺胶囊组
P
<0.
05)；与模型组比较，脾氨肽组和芪白平肺胶囊组大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平显著降低(
P
<0.
05)；芪白平肺胶囊组大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平显著低于脾氨肽组(
P
<0.
05)。见表1。
表1 4组大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平比较
3.4 4组大鼠肺功能比较 与正常组比较，模型组大鼠的FEV0.3、FEV0.3/FVC、FVC显著下降(P
<0.
05)；与模型组比较，脾氨肽组和芪白平肺胶囊组大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、FVC显著升高(
P
<0.
05)；芪白平肺胶囊组大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、FVC显著高于脾氨肽组(
P
<0.
05)。见表2。
表2 4组大鼠肺功能比较
3.5 4组大鼠BALF中白细胞总数及炎症细胞比例比较 与正常组比较，模型组大鼠BALF中白细胞总数和单核-巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞比例均明显升高(P
<0.
05)；与模型组比较，脾氨肽组和芪白平肺胶囊组大鼠BALF中白细胞总数和单核-巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞比例显著降低(
P
<0.
05)；芪白平肺胶囊组大鼠BALF中白细胞总数和单核-巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞比例显著低于脾氨肽组(
P
<0.
05)。见表3。
表3 4组大鼠支气管BALF中白细胞总数和炎症细胞比例比较
COPD是一种高发病率及高致死率的慢性炎症性疾病。COPD患者炎症反应不仅影响到整个肺脏而且涉及全身，但是局部炎症较重，直接或间接引起相关炎症因子水平升高。IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子过度释放，导致肺组织结构和功能的破坏，影响肺通气和换气，从而引起肺功能的下降，疾病进行性加重。如果不积极治疗，则会引起高碳酸血症、低氧血症、肺动脉高压等多种并发症，危及患者生命安全。TNF-α是由巨噬细胞和单核细胞分泌的一种重要的促炎因子，不仅可以诱导气道内皮细胞表达黏附分子1及其mRNA表达，促进黏液分泌，引起肺组织的增生，同时可以介导IL-6、IL-8的合成及释放，从而引起级联反应，导致炎症反应的进一步加剧。白细胞介素在炎症反应中也有重要作用，如IL-6、IL-8、IL-1β可以通过诱导巨噬细胞、中性粒细胞聚集、淋巴细胞粘附，从而释放溶酶体酶、蛋白水解酶和脂类介质等炎症介质，激化氧化应激反应,从而产生对肺实质和肺血管的慢性损伤,参与或加重COPD气道炎症反应过程。本研究结果显示，模型组大鼠FEV0.3/FVC较正常组显著降低，提示其气道阻力增加，存在气流受限和肺通气功能障碍，即肺功能降低，符合COPD模型的基本特征，表明模型复制成功。经脾氨肽及芪白平肺胶囊药物干预后，大鼠血清炎症指标、BALF中炎症细胞浸润明显降低，肺组织病理及肺功能明显改善，提示脾氨肽及芪白平肺胶囊均具有改善COPD痰瘀阻肺证大鼠炎症水平和改善肺功能的作用，但芪白平肺胶囊的治疗效果明显优于脾氨肽。
中医学将COPD归属“肺胀”范畴。《素问·大奇论》：“肺之壅，喘而两胁满。”其病理因素主要是“痰”“瘀”，患者初期多仅表现为咳嗽症状，随着病情的发展，患者可出现咳痰、胸闷、喘息等症状，与COPD有许多相似之处。肺胀之初以气虚为本，病本失治则渐累肺肾之气。《素问·评热病论》曰：“邪之所凑，其气必虚。”《证治准绳·喘》亦云：“肺虚则少气而喘。”肺气虚损，子盗母气，则肺脾两虚，水饮运化失调，聚为痰饮，壅塞肺道。此外，气为血之帅，气虚日久，血液运行受阻，则生瘀血。肺久病及肾，肾阳受损，蒸化失调，加剧痰饮的形成及壅塞肺道，且肾失纳气，则日久喘促。因此，益气温阳、化痰散瘀可为本病之治疗大法。芪白平肺胶囊方中黄芪、生晒参合而为君，两药性温而补元气、益脾肺，共奏益气温阳之功。川芎辛散温通，为“血中之气药”，活血行气，使瘀去血行；
薤白温通辛散，理气通阳，散阴寒邪气；
葶苈子辛散，善泻肺中痰饮而平喘，且具行水消肿之功，上三者共为臣药。五味子味酸性温，能上敛肺气止咳，下滋肾阴固肾平喘；
地龙性散走窜，清肺定喘、通行经络，合为佐药。诸药合用，共奏益气温阳、化痰散瘀之功。
脾氨肽是一种新型的免疫调节剂，是从健康动物脾脏中提取的肽及核苷酸类复合物，可单独或协助用于感染性疾病、变态反应性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤性疾病的治疗。脾氨肽进入人体后，作用于免疫信息传递、淋巴细胞活化和受体调节3个环节，通过调节Th1/Th2细胞因子平衡，提高机体的免疫功能，有效抑制炎症反应。
现代药理学研究发现：黄芪中黄芪多糖可调控Toll样受体4/核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信号转导通路，降低相关炎症递质的含量，从而发挥抗炎作用；
川芎可以阻碍相关炎症信号传递,影响下游蛋白的表达,发挥抗炎作用；
五味子总木脂素能够调控NF-κB、过氧化物酶体增殖物激活受体等信号通路，抑制促炎因子的表达；
地龙醇提物通过抑制毛细血管通透性，从而减轻肺部的炎症渗出，改善肺功能；
薤白可以通过6-酮前列腺素F1α下调IL-6、血栓素B的水平,从而抑制炎症反应,缓解支气管平滑肌的痉挛；
葶苈子的化合物山柰酚可通过下调NF-κB信号通路，抑制下游炎症因子分泌，从而发挥抗炎、抗氧化的重要作用；
人参麦芽酚通过清除自由基抑制脂质过氧化物的形成。同时，相关研究发现，芪白平肺胶囊中挥发性成分乙酸乙酯、4-松油醇等成分具有明显的平喘作用。因此，芪白平肺胶囊具有较好的抗炎和耐低氧作用。
综上所述，芪白平肺胶囊可明显改善COPD痰瘀阻肺证模型大鼠的肺组织病理损伤，改善其肺功能，这种作用可能与抑制炎症反应有关。然而，COPD的发生机制较复杂，芪白平肺胶囊下调相关炎症指标的作用通路尚未阐明，有待后续深入探究。