赵寿培,刘 泽，程素彩，王新芳，刘爱瑜，李晓宇，高玉红*，孙新胜
(1.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071001；
2.保定市畜牧工作站，河北 保定 071001；
3.廊坊市农林科学院，河北 廊坊 065000；
4.河北省畜牧总站，河北 石家庄 050035；
5.河北农业大学 信息科学与技术学院，河北 保定 071001)
近几年来，养殖业“减抗禁抗替抗”的呼声不断高涨，尤其《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017-2020年)》中明确提出，自2020年停止生产进口促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)、停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料后，绿色、健康、安全的“替抗”饲料添加剂的开发成为研究焦点。中药因安全无残留且具抗菌消炎、抗应激和调节机体免疫等功效逐渐被畜牧行业所关注。研究表明，中药可以提高畜禽生产性能、降低料重比并改善机体免疫机能[1-3]。近几年研究也证实，中药通过微生物发酵可使其有效活性成分分离，大大提高饲料利用率[4-5]。但是。中草药及其提取物直接用于动物饲料的生产成本较高，目前我国因提取中药有效成分产生大量的中药渣。据统计，每年我国的中药渣产量可高达3 000万t以上，而中药渣仍含有某些活性成分，且使用成本低，因此中药渣具有广阔的饲料开发前景[6-7]。
已有研究表明，中药及其药渣可用于缓解家畜热应激[8-9]。中 (兽) 医药理论认为，高温高湿饲养环境引起的应激反应属湿热所致，即感受湿热之邪，因此在热应激防治上常采用清热祛湿原则。现代医学也认为，中医学的脾胃是以消化系统为主的多系统、多功能综合单位，防治热应激可从健脾和胃入手。《本草纲目》记载：“艾以叶入药，性温、纯阳之性、通十二经、具回阳、理气血、逐湿寒等功效”。万寿菊和板蓝根具有清热解毒和凉血的功效，并且这些中药均具抑菌消炎、抗病毒和提高机体免疫力的功效[10-12]。由此可见，这些中药可被用作缓解人畜的热应激。随着近几年家畜热应激反应的加剧，尤其饲养较为粗放的羊产业因热应激已经造成了严重的经济损失，但中药缓解羊热应激的相关研究较少。基于此，本试验选择6味中药或中药渣进行组方发酵，研究夏季热应激条件下中药对育肥羔羊生长性能、表观消化率和免疫功能的影响，以期为中药的开发利用及热应激防控提供依据。
1.1 中药组方配制依据中医清热祛湿的原则，选择6味具清热干燥、除湿解毒的中药进行组方。各种中药的配比为：艾叶38.24%、万寿菊渣34.42%、板蓝根渣19.12%、大青叶3.44%、红枣2.87%和杜仲叶1.91%。各种中草药先经过清洗、烘干、粉碎、过筛(40目)，然后将所有中药混合均匀，按1∶1比例加入枯草芽孢杆菌发酵液，于固态发酵罐中发酵5～7 d，发酵温度为35～38℃，发酵完成的终点为枯草芽孢杆菌数量大于1.2×1010CFU/g。
1.2 试验设计及饲养管理试验于2020年7-10月河北省石家庄市某规模化羊场进行，羊舍为东西朝向的敞棚舍，羊均占舍面积为1.25 m2，羊舍结构特点如图1所示。将160只体质量为(38.28±0.91)kg的杜泊羊×东北细毛羊杂交断奶羔羊随机分为2组，即中药组和对照组，中药组添加日粮干物质基础1.0%的发酵中药，饲料组成及营养水平见表1。试验开始前对羊舍进行清扫消毒，每日于6:00和17:00 定时饲喂，自由采食，自由饮水。试验周期为90 d，并将1～45 d记为试验前期，46～90 d记为试验后期。
图1 试验羊舍剖面图
表1 基础日粮配方及营养水平 %
1.3 检测指标及方法
1.3.1羊舍温湿度测定 于试验羊舍内距地面1.7 m 处均匀悬挂3个温湿度记录仪(KTH-350-1，法国)，每0.5 h自动记录1次，连续记录试验期间羊舍环境温度(ta)及相对湿度(RH)，并计算温湿指数(THI)。THI=0.8×ta+RH÷100×(Ta-14.4)+46.4[13]。
1.3.2生长性能测定 分别于试验初期(第1 天)，试验中期(第45 天)和试验末期(第90 天)对各组羊逐只进行空腹称重，记录初始体质量(IBW)、中期体质量(MBW)及终末体质量(FBW)。同时每隔15 d测定饲料饲喂量和剩余料量，连续测3 d，计算干物质采食量(DMI)。并计算平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.3.3 采食行为和呼吸频率测定试验每间隔15 d 测定羊的采食行为和呼吸频率。连续记录上料后1 h 内每组完成采食羊的数量，每隔5 min记录1次，计算每个时间段的采食完成率(完成采食只数/总只数)，绘制连续的曲线图。测定呼吸频率时，于13:00 随机每组选择10只健康羊采用秒表计数下胸腹部连续张弛的次数，连续测3 min，计算每分钟的平均呼吸频率，每次连续记录3 d。
1.3.4养分表观消化率测定 分别于试验中期和试验末期收集饲料样品和粪样。采用四分法收集饲料样品，采用点收粪法于采食后收集粪便，每组随机收集6只羊的新鲜粪便，每只羊约300 g，分装成2份。1份加10%盐酸(每100 g粪样+10 mL 10%盐酸)以备测粗蛋白(CP)含量；
另1份不加酸以备测干物质(DM)、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、钙(Ca)和磷(P)等养分含量，其中有机物(OM)为计算值(OM=DM-Ash)，上述样品均-20℃保存。饲料和粪样的DM、OM、CP、EE、NDF、ADF、Ca和P参照《饲料分析及饲料质量检测技术》中的标注方法进行测定[14]。采用酸不溶灰分 (AIA)内源指示剂方法计算各养分表观消化率。
某养分表观消化率=100%-(饲料AIA含量/粪AIA含量)×(粪中该养分含量/饲料中该养分含量)×100%。
1.3.5血液理化指标测定 试验末期采集血液测定血液生理和生化免疫指标。每组随机选择6只健康育肥羔羊，早晨空腹采血，前颈静脉采血10 mL，其中2 mL装入EDTA管，立即使用全自动血液细胞分析仪(迈瑞BC-5000)测定血液生理指标。其余部分装入肝素管，3 000 r/min离心15 min，取血清于-20℃保存备测生化指标，分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、跨膜蛋白-1(Claudin-1)和闭锁蛋白(Occludin)等含量采用南京建成试剂盒按照说明书进行测定。
1.3.6胃肠道黏膜免疫因子测定 于试验末期每组随机选择5只健康育肥羔羊，禁食12 h后屠宰，立即取瘤胃腹囊中间部分及回肠中段5～10 cm，用冰浴的生理盐水洗净外壁及内容物，滤纸吸干，用载玻片轻轻刮取瘤胃上皮组织及肠黏膜，放入液氮中暂存，最后保存于-80℃。
1.4 数据分析利用GraphPad Prism 7.0对羊舍温湿度、羊的采食行为和呼吸频率进行绘图，采用SAS 9.4统计软件对生产性能、表观消化率、采食行为、血液及黏膜所测数据进行分析。其中，P≤0.05表示差异显著，P≤0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。
2.1 羊舍温湿参数的日变化规律试验期间羊舍内温湿参数变化如图2所示。由图2可知，试验期间日均ta和RH为24.17℃和71.59%。试验前期，日均温、湿度为27.95℃和75.85%，温湿指数则达79.04，育肥羔羊处于中度热应激状态，而试验后期，日均温、湿度为20.07℃和66.98%，温湿指数为66.26，羊处于非热应激阶段。
图2 试验时期环境温湿度的日变化
2.2 发酵中药对育肥羔羊生长性能的影响发酵中药对育肥羔羊生产性能的影响如表2和图3所示。从整体试验期看，饲料中添加发酵中药可以显著提高育肥羔羊ADG(P<0.05)，并降低F/G(P<0.01)。试验前期发酵中药可显著提高DMI(P<0.01)，中药组相较对照组提高了11.5%，同时显著提高了ADG(P<0.03)，并显著降低F/G(P<0.01)。而试验后期对DMI并无显著影响(P>0.05)，但可显著降低F/G(P<0.01)。由不同时期的采食量可见，中药组 15，30 d的DMI显著提高(P<0.05)，分别提高了16.7%和12.9%。
2.3 发酵中药对育肥羔羊采食行为的影响发酵中药对育肥羔羊采食行为的影响如图4所示。随着采食时间的延长，羊只采食完成率均呈现升高的趋势。并且，中药组相比对照组从采食后10 min，采食完成率有所提高，尤其是试验后期采食后15 min时，完成比例相差最大，较对照组提高了15.68%。
表2 发酵中药对育肥羔羊生长性能的影响
2.4 发酵中药对育肥羔羊呼吸频率的影响发酵中药对育肥羔羊呼吸频率的影响如图5所示。发酵中药可显著降低15 d(P<0.05)和45 d(P<0.01)的呼吸频率， 15 d时与对照组相比降低25次/min。并且试验后期呼吸频率显著低于试验前期(P<0.01)。
注：同时期内2组间标注**为差异极显著(P<0.01)，标注*为差异显著(P<0.05)，无标注为差异不显著(P>0.05)。下同
A.试验前期(1～45 d);B.试验后期(46～90 d)
图5 不同阶段发酵中药对育肥羔羊呼吸频率的影响
2.5 发酵中药对育肥羔羊表观消化率的影响发酵中药对育肥羔羊表观消化率的影响如表3所示，试验前期中药组和对照组的表观消化率并无显著性差异(P>0.05)，但育肥后期中药组DM、CP、EE、NDF、ADF、Ash和Ca均有显著提高(P<0.01)，尤其是育肥后期的CP消化率提高了13.11%。
表3 发酵中药对育肥羔羊表观消化率的影响
2.6 发酵中药对育肥羔羊血液生理指标的影响发酵中药对育肥羔羊血常规理化指标的影响如表4所示。发酵中药可以显著降低白细胞数目、中性粒细胞数目及中性粒细胞百分百比(P<0.01)，其中中药组相比对照组白细胞数目降低了33.4%，中性粒细胞数目则显著降低。同时中药组还显著提高了淋巴细胞百分比(P<0.05)。
表4 发酵中药对育肥羔羊血液生理指标的影响
2.7 发酵中药对育肥羔羊免疫性能的影响发酵中药对育肥羔羊血清及消化道(瘤胃和空肠)黏膜中免疫指标的影响如表5所示。日粮中添加发酵中药可以显著降低血清中IL-1β及IL-6的含量(P≤0.01)，并提高了ZO-1、Claudin-1及Occludin的含量(P<0.05)。同时，发酵中药还可以提高瘤胃及空肠上皮黏膜中sIgA的含量(P<0.05)。并降低瘤胃黏膜中IL-1β及IL-6的含量，同时还提高了瘤胃黏膜Claudin-1的含量(P<0.05)。对于空肠黏膜，添加发酵中药可显著降低IL-6含量(P<0.05)，并提高ZO-1和Claudin-1的含量(P<0.01)。
表5 发酵中药对育肥羔羊免疫性能的影响
3.1 发酵中药对育肥羔羊呼吸频率、表观消化率和生长性能的影响绵羊的最适摄氏温度为-3～23℃[15]，而本试验期间日均温度24.17℃，最高温度达30.31℃，并且试验前期日均温度高达27.95℃，已经远远超过其适宜生长范围，且试验前期THI为79.04，羊处于中度热应激状态[16]。研究表明，强烈持续的热应激势必影响机体的正常发育甚至对机体造成一定的损伤。由于羊汗腺较少且被毛较厚，夏季散热主要依靠呼吸道，常常通过提高呼吸频率增加热的散发，所以呼吸频率常作为热应激评价的重要指标，其对维持机体健康具有重要意义[17]。本试验中前期阶段饲料中添加发酵中药显著降低了15,45 d的呼吸频率，同时试验后期(无热应激期)羊的呼吸频率也显著低于试验前期，说明饲喂发酵中药在一定程度上可以缓解羊的热应激，这与李欣泽等[18]研究基本一致。中药中 (兽) 医药理论认为，高温高湿饲养环境引起的应激反应为湿热所致，常郁阻中焦脾胃，导致中焦脾胃运化功能障碍，因此治疗上常采用清热祛湿原则。本试验中中药组方中的艾叶、板蓝根渣和万寿菊渣为主要组成成分，艾叶性温、祛湿寒，而板蓝根和万寿菊渣均具清热解毒和凉血的功效，且组方中比例较小的大青叶同样具有解热、抗炎、利胆等功效，该组方缓解热应激的功效有可能是多种药的协同作用。也有研究认为，中药治疗或预防疾病主要源于其生物活性成分，本研究组方中的艾叶主要生物活性成分为挥发性精油和非挥发性化合物，包括黄酮类、有机酸、多糖、香豆素和较大的萜类化合物等[10]。ABDOLLAH等[19]研究表明，植物提取物黄酮和萜类可以通过清除体内多余自由基以缓解应激。另外，万寿菊提取物中的黄酮和酯类以及板蓝根提取物中的板蓝根多糖也会有部分存留于提取物剩余的中药残渣中，发挥其生物活性作用[11-12]。
热应激条件下，除了呼吸散热，羊也会通过减少采食量来减少体增热，从而维持体热平衡。本试验结果表明，夏季饲料中添加发酵中药可以显著提高采食量，缓解热应激引起的负面效应。试验15，30 d热应激条件下饲喂发酵中药的育肥羔羊采食量分别提高了16.7%和12.9%，这与张新雨等[20]研究一致，肉牛热应激条件下饲喂中药复方可以提高13.53% 的采食量。CHEN等[21]研究也表明，添加复方中药可以提高热应激奶牛10.6%的采食量。另外，本研究结果也表明，饲料中添加发酵中药可以提高羊的采食速度，这也可能是由于发酵后的中药具有特殊的香味，有助于提高羊的食欲。本试验结果还表明，中药组的育肥羔羊可显著降低料重比，这已经在单胃动物养殖中被证实[22-23]。关于肉牛的研究也认为，饲料中添加中药可以降低热应激条件下肉牛的料重比，提高饲料利用效率[21]。因此，中药可有效缓解动物热应激，改善动物的生长性能。
胃肠道是受热应激影响的主要靶器官之一，热应激条件下机体通过减缓肠道蠕动和降低消化酶的活性来降低养分消化率。本试验结果表明，虽然试验前期饲喂发酵中药对育肥羔羊的表观消化率未表现出显著性影响，但试验后期DM、CP、EE、NDF、ADF、Ash和Ca等养分的表观消化率显著提高，这可能是由于中药发挥作用较慢导致后续的正效应才能表现出来，也可能是由于前期的健康水平较高导致后期消化性能提高。关于中药影响消化率的研究效果不尽一致。单春花[24]关于奶牛的研究认为，热应激状态下饲料中添加发酵中药并未对奶牛的表观消化率产生显著性影响，这与中药成分以及动物品种、年龄密切相关。牛壮[25]在肉仔鸡饲料中添加艾草提取物发现，艾草增加了消化道中的胰蛋白酶、蛋白酶和脂肪酶活性，并改善肠黏膜形态，提高了营养物质的表观消化率。BAI等[26]研究也认为，中药中可能含有激活生长素释放肽信号通路的成分，从而改善消化不良及消化道等问题。
3.2 发酵中药对育肥羔羊免疫性能的影响血常规指标检测是通过观察白细胞、红细胞、血小板等数量变化和形态分布来判断动物个体的生理机能是否正常。本试验中，育肥羔羊白细胞、红细胞和血小板数量均处于正常范围，但发酵中药显著降低了白细胞数量，白细胞作为机体细胞免疫的重要组成部分，说明该中药组方影响了机体的免疫性能，这可能与艾叶、板蓝根渣、万寿菊渣和大青叶中所含活性成分(如黄酮类和多糖类等)的抗炎、抑菌药效有关；
同时研究表明，清热类中药也对细菌恢复其抗菌药物的敏感性有重要作用，对细菌耐药性有一定的消除作用[27-29]。因此，本试验中的发酵中药有助于机体抑菌消炎从而提高育肥羔羊的细胞免疫。
已有研究指出，热应激会影响胃肠道黏膜的通透性，改变黏膜免疫系统，进而影响机体免疫。胃肠道黏膜免疫是黏膜免疫系统最重要的组成部分[30-31]。据报道，人体内肠道黏膜约有400 m2与外界抗原直接接触，黏膜组织中的免疫细胞占所有免疫细胞的80%[32]。本研究所检测的3个胃肠道免疫因子(ZO-1、Claudin-1和Occludin)作为胃肠道黏膜的物理屏障主要指标，可以有效阻止胃肠腔内有害物质(如致病微生物、多种生物大分子和抗原)进入血液循环以维护机体健康。当这些免疫因子发生变化时，连接相邻肠上皮细胞的紧密连接遭到破坏，肠上皮间通透性增加，肠腔微生物及其代谢产物中的病原相关分子模式可与免疫细胞的模式识别受体结合，激活免疫细胞分泌炎症因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ等[33]。而炎症因子又会反过来也会作用于肠上皮细胞，导致上皮细胞间紧密连接进一步破坏[34]。本试验结果中，饲料中添加发酵中药显著提高了育肥羔羊空肠黏膜和血清中ZO-1 和Claudin-1含量，也显著提高了血清Occludin含量，说明发酵中药可维持肠黏膜组织的完整性，减少因热应激造成的肠黏膜通透性下降的风险。相关研究也指出，中草药可以改善肠道微生物菌群进而提高紧密连接蛋白的表达，从而保护胃肠道健康[35]。因此，发酵中药有助于提高胃肠道黏膜屏障的健康水平，进而提高其免疫功能。本研究结果表明，添加发酵中药显著降低了血清或胃肠道黏膜IL-1β和IL-6的含量。已有大量研究表明，中草药中含有大量多糖类、黄酮类、酚类和挥发油等活性物质，并且中草药在微生物发酵过程中通过酶解反应会释放出皂苷、类黄酮和多糖等成分，这已被证明可下调炎症细胞因子的表达[36-37]；
而发酵还可以产生大量代谢物质，主要为小分子有机酸、醇、脂肪酸和酯类等，也可以提高黄酮类活性物质，进而提高动物免疫能力[7]。促炎性细胞因子IL-1β对促进细胞生长分化、凋亡及诱导炎性反应等具有重要作用，可诱导组织细胞严重的炎性免疫反应[38]。而IL-6属于前炎症细胞因子，参与多种炎性疾病的病理生理过程，可通过抑制肠道炎症通路中IL-6含量缓解应激对机体造成的损伤[39]。可见，本研究中的发酵中药组方可以通过降低促炎性细胞因子的分泌减少应激对消化道的损害，中药组方中发挥主要作用的可能是占比最高的艾叶(38.24%)和万寿菊渣(34.42%)。相关研究也认为，艾叶水提液可以降低家兔脾脏中IL-1β的表达[40]，ZHOU等[41]研究同样表明，艾叶中的主要提取物黄酮可以通过抑制NF-κB信号通路来抑制炎症；
万寿菊提取物可显著降低小鼠血清中IL-1β、IL-6的含量[29]。另外，本研究中也检测了胃肠道黏膜sIgA含量，发现该蛋白含量用药组显著高于对照组，育肥羔羊饲喂 1.0%发酵中药时，瘤胃黏膜和空肠黏膜的sIgA含量分别提高27.09%和24.97%，这与TANG等[42]天然多糖可以提高胃肠道黏膜sIgA含量研究结果基本吻合，而本研究中的中药组方中艾叶和板蓝根等均含大量多糖类物质。而sIgA与机体免疫性能密不可分，细胞因子(如IL-6等)可通过促进T细胞及B细胞的增值，提高sIgA的分泌维持胃肠道稳态，这与细胞免疫和体液免疫均具有一定的联系，对增强黏膜表面相关抗原的免疫应答，具有重要免疫学功能[43]。
夏季育肥羔羊饲料中添加1.0%发酵中药不仅改善了血液理化指标，也通过增加胃肠道ZO-1 、Claudin-1和Occludin等含量改善了黏膜物理屏障功能，提高了机体消化和免疫水平，从而提高了育肥羔羊的生长性能，有助于缓解热应激对育肥羔羊的不利影响。
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