康宇晖，周洪善，金文杰,2,3，秦爱建,2,3
(1.扬州大学兽医学院，扬州 225000；
2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225000；
3.教育部禽类预防医学重点实验室，扬州 225000)
类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)是肠杆菌科邻单胞菌属成员，广泛分布于自然界，已从水生环境[1-3]、野生动物、家养动物[1,3-4]和人类[3,5-6]中分离到该菌，特别是水源和动物体中更为常见。该菌可存在于健康动物体内，但作为一种条件致病菌也会引发动物的败血症、肠道感染、脓肿、皮肤溃疡性损伤等疾病[7]。在人医上，类志贺邻单胞菌同样被认为是许多疾病的致病因子，如角膜炎、肺炎、骨髓炎、败血症和脑膜炎等[5,8-10]。已有许多国家从散发或暴发的急性腹泻病人粪便、血液和脑脊液中分离到该菌，且分离率有日益增多的趋势[11]。人类因类志贺邻单胞菌引发的肠炎发病情况存在较明显的地域差异，人类的感染很多是由于食入生鱼或被水污染的食物引起[5]，在东南亚地区和非洲地区的发病率较高，而在北美地区和欧洲地区的发病率相对较低[7]。
2020年10月，江苏宿迁某鹅场270日龄鹅发生了大批发病及死亡的情况，给鹅场带来了严重的经济损失。本研究对发病原因进行了探究，对病死鹅进行剖检及病原分离鉴定，并对分离菌株进行了一系列探究，以期减少鹅的死亡，降低经济损失。
1.1 材料
病死鹅来源于江苏某养殖场，270日龄，常用疫苗免疫齐全。20只6周龄健康BALB/c雄性小鼠购自扬州大学比较医学中心。血琼脂培养基购自长沙比克曼生物有限公司；
MH培养基购自青岛海博生物科技有限公司；
细菌生化反应管、药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司；
细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；
细菌16S rDNA扩增试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；
Bruker质谱仪购自布鲁克公司。
1.2 细菌分离纯化
解剖送检病死鹅，检查内脏器官病变情况，并做好记录。在超净台内，对病死鹅肝脏进行表面无菌处理，用无菌接种环蘸取肝脏内部组织，接种于血琼脂培养基，于37 ℃培养箱倒置培养24 h[12]，选取单菌落接种于新的血琼脂平板，于37 ℃温箱中倒置培养12 h[13]，得到纯化的菌落，进行革兰氏染色[14]，油镜观察。
1.3 分离菌生化试验鉴定
将纯化的单菌落接种于LB液体培养基，置于37 ℃、175 r/min摇床中过夜培养12 h，用接种针蘸取菌液后接种于8个微量生化反应管中，其中，葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、硫化氢的生化反应管37 ℃温箱中反应24 h；
枸橼酸钠、尿素的生化反应管37 ℃温箱中反应72 h。通过观察微量生化反应管的颜色变化，对分离细菌的生化特性进行判定。
1.4 分离菌基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定
使用Bruker质谱仪进行细菌鉴定，并使用Brucker细菌检测标准进行校准。采用布鲁克MBT_FC.par方法自动采集数据。将纯化的细菌薄涂于靶板，先用移液枪滴加1 μL甲酸用来破碎细菌的细胞壁，干燥后再滴加1 μL的α-氰-4-羟基肉桂酸(HCCA)，等待完全干燥，将MALDI靶板放入MALDI-TOF质谱仪中进行鉴定。当质谱鉴定得分在2.300～3.000时，鉴定结果可完全可靠地鉴定到种；
得分在2.000～2.299之间时，结果鉴定到种；
得分在1.700～1.999之间时，结果可鉴定到属；
当得分在0～1.699之间，则无可信结果。
1.5 细菌16S rDNA序列分析
取1 mL菌液，根据细菌DNA提取试剂盒说明书提取细菌DNA，用酶标仪测定DNA浓度。用细菌16S rDNA扩增试剂盒扩增细菌16S rDNA，选用试剂盒自带的引物(5′-GAGCGGATAACATTT-CACACAGG-3′；
5′-CGC-CAGGGTTTTCCCAG-TCACGAC-3′)。PCR反应体系50 μL：PCR Premix 25 μL，DNA模板 2 μL，上、下游引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，灭菌ddH2O 22 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环；
72 ℃延伸5 min。取PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其余产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序结果对比NCBI现有数据库，从而确定细菌种类，上传序列，获取登录号，最后运用软件Mega 7.0将获取的序列绘制系统进化树。
1.6 药敏试验
采用K-B药敏纸片扩散法[15]，取50 μL对数生长期菌液涂于新鲜配制的MH琼脂培养基，选取20种临床常见的药敏纸片间隔均匀地贴在平板上(纸片间至少保持2 cm间距)，于37 ℃培养箱倒置培养24 h，用游标卡尺测量各抑菌圈直径，最终对比美国临床与实验室标准协会(CLSI)执行标准，评估分离菌对各抗菌药的敏感程度[16-17]。
1.7 小鼠致病性试验
取纯培养菌落置于LB液体培养基，于37 ℃摇床150 r/min震荡培养12 h，取出菌液，将菌液浓度调整至D600nm为1，此时菌液浓度为1.0×109CFU/mL，再做10倍梯度稀释，使菌液终浓度分别为1.0×106～1.0×109CFU/mL。将20只6周龄雄性健康BALB/c小鼠均分为5个组，其中4组作为感染组，分别腹腔注射不同浓度的菌液，0.5 mL/只，1组作为对照组，腹腔注射等体积LB培养基。每12 h观察小鼠一次，若有死亡，立即解剖并观察病变，且从小鼠肝脏再次进行细菌分离鉴定，同时根据小鼠死亡情况计算细菌的半数致死量(LD50)。
2.1 病死鹅剖检与细菌分离纯化结果
剖检结果显示，病死鹅肝脏肿大淤血，腺胃乳头黏膜出血，肠道黏膜出血，卵母细胞变形变性，腹腔内有卵黄碎片，喉头气管黏膜充血、有黏液性分泌物。纯化后的细菌菌落在血平板上光滑湿润，呈灰白色，菌落直径大小约1 mm(图1A)。油镜下观察，可见此菌呈短杆状，革兰氏染色阴性，多成对排列，也有短链状排列或成丛排列(图1B)。
图1 分离菌血琼脂培养菌落形态(A)及革兰氏染色镜检图(B，1 000×)
2.2 生化试验结果
细菌生化试验结果显示，此细菌可发酵葡萄糖、麦芽糖、枸橼酸盐、尿素，而接种于乳糖、甘露醇、蔗糖、硫化氢的未出现任何变化(表1)。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，生化结果对比发现，分离菌与类志贺邻单胞菌的生化特性相符合。
表1 分离菌生化试验结果
2.3 MALDI-TOF MS鉴定结果
为降低质谱仪出现错误判断的概率，本次试验利用MALDI-TOF MS对该细菌进行了2次鉴定，两次质谱鉴定得分分别是2.356和2.420，得分均高于2.300，表示鉴定结果可靠，可以完全精确到种的水平，经数据库检索，认为此菌为类志贺邻单胞菌。
2.4 细菌16S rDNA序列分析
16S rDNA琼脂糖凝胶电泳结果显示,纯培养菌的PCR扩增产物大小为500 bp左右(图2)，与预期片段大小一致。系统进化树结果显示，分离菌与已公开发表的多株类志贺邻单胞菌的序列相似度达到98%以上，具有高度同源性(图3)，与其他鉴定试验结果一致。将该分离株命名为SQ20201005,16S rDNA序列上传至GenBank，获取登录号为OM883834。进一步确定该分离株为类志贺邻单胞菌。
M，1 kb DNA Ladder；
1，待检样品；
2，阴性对照
图3 基于16S rDNA构建的系统发育树
2.5 药敏试验
药敏试验结果显示，在受试的20种临床常用抗菌药中，分离菌株对左氧氟沙星、美罗培南、头孢西丁、庆大霉素等10种抗菌药敏感，对四环素、头孢吡肟、头孢他啶、头孢唑林中介，对阿奇霉素、复方新诺明、氨苄西林等6种抗菌药耐药(表2)。
表2 分离菌药敏试验结果
续表
2.6 小鼠致病性试验结果
观察感染组小鼠发现，5.0×108和5.0×107CFU组小鼠在注射细菌后24 h内全部死亡，5.0×106CFU组在感染后24 h内表现出明显的精神不佳、毛发蓬乱、不喜运动等，5.0×105CFU组和空白对照组无明显眼观改变。及时剖检死亡小鼠，可观察到小鼠肝脏肿大且有大面积点状出血，脾脏肿大发黑，肠腔积液严重，肠道内容物呈胶冻样。注射后72 h，5.0×106CFU组小鼠精神状态逐渐好转，所有小鼠均可在注射后15 d正常存活且表现健康。小鼠致病性试验具体结果见表3。用改良寇氏法计算，得知此细菌的LD50为5.0×106.5CFU。
表3 分离菌小鼠致病性试验结果
邻单胞菌属中仅有类志贺邻单胞菌一个成员，其在2005年之前一直被划分于弧菌科，后被划分于肠杆菌科，且于《伯杰氏系统细菌学手册》(第2版)中正式改为肠杆菌科。人医对于类志贺邻单胞菌的研究最早始于1972年，动物医学研究者也相继在鱼、麻鸭、犬、灰狼等体内分离到此细菌，并多次报道其可引起动物发病死亡。由于类志贺邻单胞菌主要生活于淡水水体中[18]，所以目前兽医界对于类志贺邻单胞菌的报道多集中于各种水产动物，如草鱼[19]、鲟鱼[20]等，对于哺乳动物及禽类感染类志贺邻单胞菌的报道则相对较少。本研究在江苏宿迁某鹅场发病死亡的鹅肝脏中分离到1株类志贺邻单胞菌，通过查阅文献，发现此前尚未有过类志贺邻单胞菌可引起鹅发病死亡的报道，此发现丰富了鹅致病性微生物的种类，也丰富了类志贺邻单胞菌的宿主范围。
病死鹅剖检结果显示，此菌对鹅的肝脏、胃肠、卵巢等均有不同的侵害，且病变明显，对比陈维刚等[21]在对赤麻鸭感染类志贺邻单胞菌导致死亡的报道中对剖检病变的描述，死亡赤麻鸭肝脏肿大、有深色瘀斑，肠管肿大，发现鹅在感染后与赤麻鸭感染后有诸多相似的病变，据此推测，类志贺邻单胞菌对不同水禽的致病方式及危害可能存在较高的相似度。由于类志贺邻单胞菌适宜在夏秋季较高温度的水源中生长，使得在水中自由活动的水禽及水产品易被感染；
此外，由于类志贺邻单胞菌的常见宿主是鱼[22]，水禽多以鱼类为食，故在捕食鱼类的同时也极易通过消化道感染类志贺邻单胞菌。针对本次鹅感染类志贺邻单胞菌的病例推测其最初的感染途径，由于发病鹅数量多，且发病时间较集中，故认为由消化道感染的可能性最大，鹅群食入被污染的水或饲料或遭受水体污染的带菌鱼虾导致细菌进入消化道，细菌由消化道穿透肠黏膜免疫屏障抵达机体各处，对机体造成损伤。
药敏试验结果显示，分离的类志贺邻单胞菌具有多重耐药性，对比张效平等[23]从江鳕中分离到的类志贺邻单胞菌的药敏试验结果发现，2株细菌都具有多重耐药的特性，其中，江鳕中分离到的菌株对复方新诺明表现中度敏感，而本研究中的分离菌株对复方新诺明表现耐药，提示了复方新诺明在养殖中的使用很可能存在长期过量的情况，导致类志贺邻单胞菌逐渐对其耐药。在养殖过程中长期使用多种抗生素抑制细菌生长，造成了环境污染及细菌耐药性的增强，因此，应在养殖过程中轮换用药或穿梭用药，避免某一种或几种抗生素长期使用对细菌造成的压力，从而减缓细菌耐药基因的进化。在药物的选择问题上，一方面要考虑到药物的敏感性，另一方面还要考虑到所涉及的药物是否为兽医临床禁用药。在用药期间，可采取全群拌料饲喂的方式[21]，以确保对群体内每只鹅都有药物摄入，同时对养殖场环境要进行彻底地清扫消毒，防止细菌反复滋生。
小鼠致病性试验结果表明，本研究分离的类志贺邻单胞菌有较强的致病性，在动物医学和公共卫生方面都意义重大，2021年，韩国学者Kyoo等[24]报道了1起7岁灰狼因感染类志贺邻单胞菌而死亡的病例，对死亡的灰狼进行剖检发现，其肝脏、脾脏肿大、腹腔积液等许多病理变化都与感染小鼠的症状极其相似，由此可推测，类志贺邻单胞菌在不同哺乳动物体内的致病途径及机理大体相似，且对不同哺乳动物都具有较强的致病性，因此，不论是在兽医临床还是人医临床中，都应该加强对其的重视与防范。
本研究从鹅肝脏中分离到1株多重耐药的类志贺邻单胞菌，首次报道了类志贺邻单胞菌可造成鹅感染发病及死亡，丰富了鹅的致病微生物；
鹅源类志贺邻单胞菌同样可引起小鼠死亡，半数致死量为5.0×106.5CFU，有较强的致病性，应加强防范。