朱寅初，王宏宇，2，云 涛，华炯钢，叶伟成，倪 征，陈 柳，张 存，*
(1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021；
2.南京农业大学 动物医学院，江苏 南京 210095)
雏鹅痛风是当前国内养鹅业最重要的传染病之一，自2016年在我国首次出现以来，一直呈蔓延趋势，陆续在黑龙江、山东、河南、安徽、江苏、福建、广东等主要养鹅地区暴发，给我国养鹅业造成严重经济损失。临床调查显示，鹅胚和5～20日龄雏鹅均可被星状病毒感染，死亡率在20%～40%。对病死雏鹅进行剖检，大多可观察到典型的痛风症状，即在腹腔、心脏表面有明显的尿酸盐包膜，肾脏红肿，胆囊内白色尿酸盐积聚，甚至部分关节处也出现尿酸盐沉积。在排除营养性疾病的情况下，经病原学鉴定发现，该病由鹅星状病毒(，GAstV)感染引起。目前，该病的致病机制仍不清楚，临床上并无有效的疫苗、抗体或抗病毒药物可以有效控制该病传染，只能依靠管理预防。因此，加强对鹅星状病毒的病原分析和监测，对于我国养鹅业发展来说具有积极意义。
不同宿主来源的星状病毒广泛存在于自然界中。据报道，在哺乳动物中，星状病毒在牛、羊、猪、狗等动物中普遍存在。禽源星状病毒主要感染火鸡(TAstV-1和TAstV-2)、鸡(ANV和CAstV)、鸭(DAstV-1和DAstV-2)，多表现为肠炎腹泻。在2016年前，并无鹅源星状病毒的报道。星状病毒为单股正链无囊膜RNA病毒，病毒粒子约30 nm，基因组全长约7 kb，两侧为5′非翻译区(5′-UTR)和3′非翻译区(3′-UTR)(具PolyA尾)，包含ORF1a、ORF1b、ORF2共3个开放阅读框(ORF)，其中，ORF1a主要为非结构蛋白，ORF1b为极保守的RNA聚合酶，ORF2则为高变异的衣壳蛋白。星状病毒基因组小，易变异，对环境和宿主的适应能力强，甚至会发生跨物种的传播。
浙江省养鹅产业主要养殖朗德鹅，及地方品种太湖鹅、浙东大白鹅。自2019年末起，浙江省内部分地区连续出现雏鹅大范围死亡的情况，剖检后可见心、肝表面白色尿酸盐沉积，肾肿大。为此，本研究特采集浙江地区雏鹅病料，通过病原分离鉴定和回归试验等确定其为鹅星状病毒感染。同时，通过核酸测序，对分离的鹅星状病毒进行遗传进化分析，以期为该病的地区流行、变异等提供理论参考。研究结果也将有助于对该病的深入研究和科学防控。
1.1 试验材料
1.1.1 病料样本
于2019年12月—2020年12月，在浙江地区鹅场采集30只具有痛风症状的病死雏鹅的肝、肾、肠样本。
1.1.2 主要试剂
磁珠法病毒DNA/RNA抽提试剂盒，广州市济帆科技生物有限公司；
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0(DNA纯化试剂盒)、DNA Marker 2000、DNA Marker 4500，宝日医生物技术(北京)有限公司；
HiScript II One Step RT-PCR Kit(Dye Plus)(PCR扩增试剂盒)和ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(同源重组试剂盒)，南京诺唯赞(Vazyme)生物科技股份有限公司；
E. Z. N. A.Plasmid Mini Kit(质粒提取试剂盒)，美国Omega Bio-Tek；
DMEM细胞培养液、胎牛血清(GBICO)、DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)和FITC(异硫氰酸荧光素)标记的山羊抗兔IgG抗体，上海碧云天生物技术有限公司。
1.1.3 试验动物和细胞
10日龄健康鹅胚、鸭胚和鸡胚，鸡肝癌(LMH)细胞，及1日龄健康雏鹅。
1.2 试验方法
1.2.1 样本剖检与处理
剖检临床猝死雏鹅，主要观察心、肝、肾、胆囊等主要器官，并划线分离细菌。另取样本加入无菌PBS缓冲液研磨匀浆，高速离心后取上清过滤，-80 ℃备用。
1.2.2 核酸提取与PCR鉴定
取匀浆液，使用磁珠法病毒DNA/RNA抽提试剂盒提取样品中的病毒核酸，以其为模板，使用PCR扩增试剂盒进行PCR扩增，分别检测坦布苏病毒(，TMUV)、鹅细小病毒(，GPV)、鹅呼肠孤病毒(，ARV)、鹅星状病毒(，GAstV)。PCR反应体系(20 μL)：2×One Step Mix 10 μL，One Step Enzyme Mix 1 μL，ddHO 6 μL，上、下游引物(表1)各1 μL，RNA模板1 μL。PCR反应程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 min，35个循环；
72 ℃ 7 min；
4 ℃ 保存扩增产物。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测分析后，用于测序鉴定。
1.2.3 病毒分离
经PCR检测判定为GAstV阳性的病料，按每胚200 μL的剂量，经尿囊腔接种至10日龄鹅胚，37 ℃孵育并观察5 d。收集尿囊液和组织匀浆后继续接种鹅胚，连续传代至第5代，收集尿囊液并再次经PCR检测确认。此外，尝试使用鸡胚和鸭胚进行分离与病毒适应。
1.2.4 病毒基因组测序与序列分析
使用DNA纯化试剂盒提取、纯化病毒核酸，之后由上海凌恩生物科技有限公司在Illumina Novaseq 6000平台上完成全基因组序列测序，借助ABySS软件进行基因组组装，在与NCBI数据库、SwissProt数据库比对后，注释功能蛋白。根据NCBI数据库中收录的其他鹅星状病毒序列，使用MEGA 7.0软件进行核酸和氨基酸序列比对，采用邻接法(neighbour-joining method，NJ)构建系统进化树，以Booststrap进行程序分析，检验值1 000。
1.2.5 ORF2重组表达质粒构建
根据测序得到的病毒全基因组序列，应用Oligo软件对GAstV ZJLD20 ORF2序列全长和ZJC14-spike序列设计特异性引物。提取病毒核酸后，反转录成cDNA，PCR扩增目的片段，经琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段。将pET28a质粒经HⅠ和R Ⅰ双酶切，使用同源重组试剂盒将目的片段与酶切后的pET28a质粒反应后转化至DH5α感受态细胞，在含有50 μg·mL卡那霉素的抗性LB平板上挑选单克隆，经PCR鉴定后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。选择测序正确的阳性克隆菌株提取质粒，转化至BL21表达菌株。
1.2.6 ORF2蛋白表达与多克隆抗体制备
挑取含有pET28a-ORF2重组质粒的BL21单菌落，接种至含有卡那霉素(50 μg·mL)的LB液体培养基中，37 ℃摇床振荡培养，至菌液约为0.5时加入1 mmol·LIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达5 h，离心，收取菌体沉淀。用溶菌酶处理菌体沉淀，经超声破碎后高速离心，将上清和沉淀用镍柱亲和层析纯化后，一部分用于SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，剩余蛋白于-80 ℃冻存。
将纯化蛋白与弗氏佐剂按照体积比1∶1的比例混合，乳化完全，背部皮下多点注射免疫新西兰大白兔，每只免疫蛋白量500 μg，一免使用弗式完全佐剂，二免、三免为弗氏不完全佐剂，间隔14 d。三免后10 d采血，37 ℃ 2 h，4 ℃低温静置过夜，离心收集血清。将ORF2蛋白偶联至树脂上，再次纯化高免血清，得到多克隆抗体。
表1 用于试验的引物基本信息
1.2.7 LMH感染与IFA(间接免疫荧光)观察
使用含10%胎牛血清的DMEM营养液，于37 ℃、5% CO环境下培养LMH。将细胞均匀铺入12孔板(每孔约含2×10个细胞)，待其生长过夜至80%长满，接入病毒液孵育1 h，之后换成含2%胎牛血清的DMEM营养液(简记为2%维持液)，培养2 d后进行间接免疫荧光(IFA)观察。向细胞平皿中加入固定液(丙酮、甲醛体积比1∶1混合)，固定1 h，用PBS缓冲液洗涤3次，洗净固定液，接着按1∶500的比例稀释高免血清，加入细胞孔，37 ℃孵育1 h，用PBST缓冲液洗涤3次，将FITC标记的羊抗兔二抗按照1∶400的比例稀释后37 ℃孵育1 h，用PBST缓冲液洗涤3次，之后保存于60%甘油中，在Zeiss AxioVert.A1荧光显微镜(德国卡尔蔡司)下观察。
2.1 临床剖检症状与RT-PCR检测鉴定
本研究共采集到30份病料，发病雏鹅表现精神萎靡，采食减少，久卧不动，四肢瘫痪，突然死亡。剖检观察到，心和肝表面有大量白色尿酸盐积聚包裹，肾异常肿胀明显，部分关节腔有点状尿酸盐出现(图1)。研磨病料、提取核酸后，使用双重RT-PCR检测，结果显示，所有样品在对应位置处均出现目的条带，说明全部病料均为星状病毒阳性，其中，2份样品系2种基因型(Ⅰ型和Ⅱ型)鹅星状病毒的混合感染，其余皆为新型(Ⅱ型)鹅星状病毒感染。此外，与GPV、ARV和TMUV对应的特异性引物检测结果皆为阴性，表明发病雏鹅并未出现与其他种属病毒的混合感染。
A，心、肝表面尿酸盐沉积包裹；
B，肾红肿；
C，胆囊内尿酸盐积聚；
D，部分临床样品双重RT-PCR检测结果。M，DNA marker；
N，阴性对照。A， Urate deposition on the surfaces of the heart and liver；
B， Severe nephritis with hemorrhage and swelling；
C， Urate crystals accumulated in the gallbladder；
D. Results of double RT-PCR for some clinical samples. M， DNA marker；
N， Negative control.图1 发病雏鹅的剖检结果与双重PCR检测结果Fig.1 Results of necropsy and double PCR for diseased goslings
2.2 病毒分离纯化
病料经匀浆后过滤，接种10日龄鹅胚，连续盲传至F8代，分离得到不同基因型的GAstV各一株，分别命名为ZJC14(GAstVⅠ型)和ZJLD20(GAstVⅡ型)。其间，鹅胚出现不规律死亡，但始终无法进行明显的死亡特性统计。死亡胚胎通体发红，有肿胀。在传代分离过程中发现，Ⅰ型GAstV适应性更强。混合感染样品在连续传代后，PCR方法已无法检测到II型GAstV。此外，使用鸡胚、鸭胚等不同胚体进行病毒接种传代发现，Ⅱ型GAstV无法增殖，而Ⅰ型GAstV可在鸭胚中稳定增殖。
将分离得到的ZJC14和ZJLD20接种LMH后经过8代盲传，均无细胞病变产生。分别取上清液和细胞裂解液提取核酸，用PCR检测目的基因发现，ZJLD20在上清液和细胞中均可检测到，说明其可在LMH中增殖；
而ZJC14无法在LMH上繁殖，检测结果为阴性(图2、图3)。此外，未从组织中分离到任何细菌。
图2 鹅胚和LMH细胞病毒分离结果Fig.2 Isolation of GAstV from goose embryo and LMH cells
M，DNA marker；
1，ZJLD20鹅胚检测结果；
2，ZJC14鹅胚检测结果；
3， ZJLD20 LMH检测结果；
4，ZJC14 LMH检测结果。N，阴性对照。M， DNA marker；
1， PCR result of ZJLD20 in goose embryo；
2， PCR result of ZJC14 in goose embryo；
3. PCR result of ZJLD20 in LMH cell；
4， PCR result of ZJC14 in LMH cell. N， Negative control.图3 基于RT-PCR的鹅胚和LMH中鹅星状病毒检测结果Fig.3 RT-PCR results of GAstV replicated in goose embryo and LMH cells
2.3 全基因组序列分析
病毒基因组测序结果显示，两株病毒皆为鹅星状病毒，ZJC14长7 297 bp，ZJLD20长7 148 bp。除两侧UTR区域外，病毒基因组主要包含3个ORF区域：ORF1a长3 223 bp，ORF1b长1 551 bp，ORF2长2 115 bp。ORF1a和ORF1b之间包含10个核苷酸的重叠区域，该重叠区域中含有一个高度保守的标志性的核糖体移框信号AAAAAAC。
全基因组核酸序列进化分析结果显示，两者虽然同为鹅源星状病毒，但进化关系差异较大，相似性低(图4)。ZJC14与AHDY、SCCD毒株的亲缘关系较近，均可认为是国内最早报道的鹅星状病毒湖南分离株FLX的变异毒株，且在进化关系上与CAstV和DAstV-4更近；
而ZJLD20与FLX、AHDY等鹅星状病毒的亲缘关系较远，但与近几年流行性更广的新型鹅星状病毒毒株SDPD、GD、HNXX-6、HNSQ-6等的亲缘关系更近。根据当前的分类，ZJC14和ZJLD20分别属于鹅星状病毒Ⅰ型和Ⅱ型。
图4 鹅星状病毒核酸序列的遗传进化分析Fig.4 Phylogenic analysis of goose astrovirus based on nucleotide sequences
基于ORF2编码的氨基酸序列构建的遗传进化树也显示，ZJC14和ZJLD20分属2个分支，遗传差异巨大，亲缘关系较远(图5)。
图5 鹅星状病毒ORF2氨基酸序列的遗传进化分析Fig.5 Phylogenetic analysis based on amino acid sequences of ORF2
鉴于序列上的巨大差异，虽然ZJC14和ZJLD20同为鹅源星状病毒，但是ZJLD20与SDPD等新型星状病毒并不是由更早出现的FLX等毒株演变而来的。
2.4 重组表达载体构建
以ZJLD20和ZJC14病毒基因组为模板，反转录成cDNA，经高保真酶PCR扩增得到2 115 bp的ORF2目的片段和834 bp的纤突片段(Spike)，跑胶纯化。提取原核表达质粒pET28a，酶切后回收，经同源重组将目的片段克隆至原核表达载体，转化后挑菌，经菌液PCR鉴定、测序后获得阳性重组载体pET28a-ORF2和pET28a-Spike。将阳性质粒经化学转化至BL21感受态细胞中，挑菌，PCR鉴定正确后，保存备用(图6)。
A，PCR检测重组载体；
B，SDS-PAGE检测蛋白；
C，Western-blot检测多克隆抗体。M，Marker；
N，阴性对照。A， PCR detection for recombinant vectors；
B， SDS-PAGE detection for protein expression；
C， Western-blot detection for polyclonal antibody. M， DNA marker；
N， Negative control.图6 鹅星状病毒ORF2的原核表达载体构建与蛋白表达Fig.6 Construction of ORF2 recombinant plasmid and protein expression
2.5 衣壳蛋白表达与多克隆抗体制备
携带pET28a-ORF2阳性质粒的BL21菌株经IPTG诱导5 h后，经溶解超声破碎和镍柱亲和层析后获得目的蛋白。SDS-PAGE检测显示，依据ZJLD20 ORF2表达所获取的目的蛋白形成分子量约为83 ku的特异性蛋白条带，而ZJC14纤突区域(即Spike)表达约31 ku，与理论预测值相符，且目的蛋白条带染色明显，条带单一。经IPTG诱导后，衣壳蛋白ORF2以包涵体形式表达，纤突区域在上清中表达。
将纯化后的蛋白按照每只500 μg的剂量与弗氏佐剂乳化混匀，皮下多点注射免疫新西兰大白兔，经3次免疫后，将目的蛋白偶联至亲和层析柱上，洗脱后获得纯化多克隆抗体。
2.6 Western Blot与IFA鉴定
将ZJLD20株接种至LMH上，37 ℃孵育1 h后，用PBS缓冲液洗涤后换用2%维持液，2 d后收集细胞样品。弃去细胞营养液，加入RIPA裂解液，4 ℃反应15 min后收集样品，离心取上清，加入SDS-loading缓冲液，100 ℃煮沸10 min。在SDS-PAGE电泳后进行Western blot检测，一抗使用制备的多克隆抗体(1∶500)。曝光显色后，在预期位置可见明显条带，而未接毒的LMH细胞无条带(图7)，说明可排除非特异性蛋白的影响。IFA观察发现，感染病毒的细胞内出现绿色荧光信号，即多克隆抗体可与细胞内增殖的病毒发生免疫反应。综合两者结果，说明制备的多克隆抗体具有良好的反应原性。ZJC14因不能在LMH中增殖，因此并未用其纤突结构蛋白制备的多克隆抗体进行Western blot检测。
Mock，空白对照。Mock， Blank control.图7 基于Western blot和IFA的ORF2多克隆抗体与鹅星状病毒GAstV ZJLD20的免疫反应结果Fig.7 Western blot and IFA identification result of ORF2 polyclonal antibody with GAstV ZJLD20
报道显示，禽源星状病毒主要包括鸭源、火鸡源，可针对性感染不同宿主，彼此间交叉感染的可能性小，主要引起肠炎、肝炎和肾脏疾病。当前，危害较为严重的是在雏鹅中广泛流行的鹅源星状病毒，对此需要给予高度重视。雏鹅星状病毒是近年新发病原，2014年最早发现的湖南株星状病毒FLX(GAstVⅠ)以肠炎为典型症状；
但是，随后各地出现以内脏尿酸盐沉积为典型特征且急性猝死的传染病，经鉴定，病原为新型鹅星状病毒(GAstVⅡ)。此后，鹅星状病毒遍布鹅养殖大省。浙江省于2019年末开始有养殖场发现雏鹅群发性死亡情况。经临床剖检观察，内脏表面有大量白色尿酸盐沉淀。本研究在浙江省内数个养殖场采集到30份病料样品，经实验室双重RT-PCR检测，确定均有鹅星状病毒感染，其中有2份病料系2种基因型鹅星状病毒的混合感染，其余均为新型鹅星状病毒(GAstVⅡ型)单独感染。试验分离到这2种基因型的鹅星状病毒各1株，并且观察到与AHDY亲缘关系较近的鹅星状病毒ZJC14对鹅胚的适应性强于新型鹅星状病毒ZJLD20，且其可在鸭胚上传代，但是两者都无法在鸡胚上繁殖。将这2株病毒在LMH上进行传代适应时发现，虽然两者均无法产生细胞病变，但是ZJLD20毒株可在LMH中稳定增殖，而ZJC14则完全无法适应，与胚体传代结果完全相反。鹅星状病毒体外分离培养的复杂性为后期的研究带来许多困难。
基因组测序结果显示，分离到的2个毒株在遗传进化上差异巨大，亲缘关系较远。ZJC14与安徽AHDY株、湖南FLX株和SCCD株的亲缘关系较近，但目前分离得到的毒株较少。FLX株最先是在出现肠炎的病鹅中检测得到的，且攻毒试验中均出现明显腹泻现象，表明其可能与肠炎相关。ZJLD20与后期发现的GD、SDPD等的亲缘关系较近，说明其属于新型雏鹅星状病毒。此类病毒被认为是目前引起雏鹅痛风死亡的主要病原。现有的临床调查显示，新型鹅星状病毒在有痛风症状的雏鹅中普遍存在，大多数为单一基因型感染；
但是也有报道发现其采集到的雏鹅病料中94%的样品呈2种鹅星状病毒的混合感染。此外，鹅细小病毒与星状病毒的混合感染也有出现。因此，鹅星状病毒在生产环境中的感染情况较为复杂，不能一概而论，存在地域差异。但要特别指出的是，GAstVⅠ型病毒单独感染导致痛风症状的临床病例在本研究检索范围内尚无报道。研究人员在实验室环境下尝试将不同基因型鹅星状病毒做单独和混合攻毒试验发现，单独感染的毒株也可造成雏鹅死亡，肾肿大，并出现腹泻、精神抑郁的情况，但是在是否会引起内脏尿酸盐沉积情况的描述上存在较大差异。部分研究显示，只感染GAtsVⅡ型毒株即可引起典型的痛风现象，甚至传代胚体也会出现类似白色沉积；
另有研究则称，混合感染的致死能力强于单一星状病毒感染，有且只有混合感染才会出现内脏尿酸盐沉积现象；
也有研究人员使用与FLX亲缘关系较近的毒株进行攻毒，亦复制出痛风症状。鉴于鹅星状病毒的致病机制尚未明确，2个毒株与雏鹅的痛风症状及其致死能力存在何种联系仍有待发掘。
鉴于雏鹅星状病毒的流行情况，有效的检测与防控手段在现阶段仍是必要的。为此，本试验表达了2种星状病毒的ORF2衣壳蛋白。衣壳蛋白为星状病毒主要的结构蛋白，位于病毒粒子表面，包裹病毒，能够形成纤突结构。该结构蛋白是刺激宿主产生免疫反应的主要组分，也是细胞表面受体识别的关键区域。根据氨基酸序列分析可知，两种鹅星状病毒ORF2蛋白序列差异较大，而同一进化分支内鹅星状病毒的ORF2序列一致性很高，因而推测其具有鉴别诊断的作用。本试验成功地原核表达了ZJC14株的纤突结构和ZJLD20的ORF2蛋白，诱导后纯化得到预期大小蛋白，免疫得到的兔血清制备多克隆抗体，与蛋白可以发生较好的结合，彼此间无交叉反应。此外，ZJLD20 衣壳蛋白制备的多克隆抗体可与LMH中增殖的病毒发生特异性免疫反应，表明衣壳蛋白具有良好的免疫原性。综上，衣壳蛋白作为抗原靶标也适合于鹅星状病毒毒株血清学检测方法的建立，这有助于应对其在鹅群中暴发的需要，并可为血清学流行病学的检测建立基础。
浙江省内地方品种和引进的商品化品种鹅群较多，养殖成规模化。另外，当前鹅胚集中异地孵化，雏鹅的大范围流通，以及“公司加农户”的养殖方式等情况，更易造成病毒的大面积传播，防控难度较大。一旦孵化场所或者种鹅受到感染，后续种蛋和雏鹅将不可避免地面临巨大风险，且周而复始难以根除。因此，对雏鹅星状病毒引起的传染病不可忽视，应继续深入调查监测。
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