孙淑欣，刘慧聪，冯雪锋，张志芳，贾海丽
（商丘学院，河南商丘 476000）
设施栽培是综合应用工程装备、生物及环境技术，创造适宜的蔬菜生长环境，实现蔬菜高效生产的现代农业生产方式。黄瓜（L.）因其产量高，经济利益高，市场需求高，在我国蔬菜产业中占有重要地位，也是我国设施栽培的主要蔬菜作物之一。由于生产条件限制、种植习惯以及经济利益因素，设施栽培种植面积逐年增加。
设施栽培蔬菜比传统种植产量高、质量好、上市早，但其也存在诸多不足，设施栽培黄瓜易出现病虫害，有明显连作障碍现象。连作障碍形成的主要原因是土壤微生物群落结构和功能类群发生变化，导致土壤微生态系统失衡。土壤微生物在土壤中扮演着重要角色，对土壤养分的吸收转化及作物生长发育具有显著影响。研究表明，连作使属水平上真菌和细菌群落结构发生变化，根际土壤微生物群落多样性降低，有益微生物丰度减少、有害微生物丰度增加。连作也会使土壤发生酸化，盐分积累，并且随着连作年限的增加，土壤酸化和盐渍化会加重，同时连作易引起作物营养元素缺乏、化感及自毒作用。微生物是评价土壤肥力的一种关键指标，也是土壤生态系统重要组成部分，研究土壤微生物群落结构变化有助于明确设施栽培中连作障碍发生机制，能够更好的种植作物，以获得更高产量，同时也在一定程度上提升作物的品质。
因此，本研究以设施栽培黄瓜不同连作年限的根际土壤为研究对象，通过形态学鉴定研究黄瓜不同连作年限对根际土壤真菌多样性及群落结构组成的影响，以此初步探索黄瓜连作障碍的形成机制，以期为后期缓解设施黄瓜连作障碍提供参考。
1.1 样品采集
土壤样品采集于2021 年3 月，采集地点为河南省洛阳市洛龙区李楼镇董村，在设施栽培黄瓜连作5 年、12 年以及未栽培过蔬菜的温室外土壤采用“五点取样法”进行土样的采集。取距离地面4～10 cm 的土壤，最后混合土样，去除杂草后，立即放入干冰中速冻，带回实验室放入-80℃冰箱中保存，用于微生物多样性的研究，不同土样分别做上标记，并详细记录样品采集的日期、地点及相关信息。
1.2 土壤真菌分离
采用稀释平板法，孟加拉红培养基进行土壤真菌分离。称取1 g 土壤置于9 mL 无菌水中，充分震荡混匀，用移液枪吸取1 mL的悬浮液置于另一9 mL的无菌水中，充分震荡混匀，再从此悬浮液中吸取1 mL悬浮液置于新的9 mL的无菌水中，同样震荡摇匀，同样的方法稀释至10，选用10、10、10、10四个梯度，每个梯度涂布10 个平板，标明日期、土样及浓度，然后用移液枪分别从相应的土壤稀释液中吸取200 μL，用涂布器涂布均匀，放置于25℃恒温培养箱中培养5～7 d，然后对真菌菌落进行计数，之后转移到PDA 培养基上进行纯化。
1.3 土壤真菌纯化与鉴定
涂布5 d 后观察菌落生长情况，根据菌落形态、颜色以及长出时间不同，用挑针挑取菌落边缘菌丝在新PDA 培养基25℃恒温培养箱进行培养，纯化后3～5 天对纯化的菌落进行形态特征观察，并做相应记录。然后通过显微镜，观察纯化菌菌丝结构和孢子形态特征，根据真菌形态分类学原理，参照相关资料对分离的真菌进行形态学鉴定，初步确定各分离菌的种属地位。
1.4 数据处理
真菌培养5 d 后开始统计并记录菌落数，并分别对三种土样中分离出来的土壤真菌菌落数量进行分析比较，分离率计算公式如下：
真菌分离率（%）=某一分离真菌的菌落数/所有分离真菌的菌落数×100
采用多样性指数（"）、丰富度指数（）、均匀度指数（）和Jaccard 相似性指数（）对土壤真菌群落结构特征进行分析。
＝/其中，为第种物种个体数，为总个体数，为每个样品中的物种总数。
其中a，b 表示两种生境类型中的真菌的属数或种数；
c 表示两种生境中共有的真菌属数或种数。
根据Jaccard 相似性系数原理：当为0.00～0.25 时，为极不相似；
当为0.25～0.50 时，为中等不相似；
当为0.50～0.75 时，为中等相似；
当为0.75～1.00 时，为极相似。
2.1 不同连作年限土壤真菌群落结构组成
通过对设施栽培黄瓜连作5 年、12 年以及未栽培过蔬菜的温室外土壤进行采集，经分离、纯化，大田土样共分离出了75 株菌株，黄瓜连作5 年的土样分离出96 株菌株，黄瓜连作12 年的土样分离出236 株菌株。经形态学鉴定，3 种土样在属水平上共包含12 属31 种（如图1 至图12），其它139 株不产生子实体结构，统一归为不产孢类群真菌。其中大田土样分离和鉴定出10 属17 个种，已鉴定属包括根霉属、毛壳菌属、串珠菌属、青霉属、曲霉属、壳色多隔孢属、毛霉属、地霉属、轮枝孢属和链格孢属；
设施黄瓜连作5 年的土样初步鉴定出8 属15 个种，已鉴定属包括曲霉属、青霉属、根霉属、毛霉属、地霉属、轮枝孢属、腐霉属和链格孢属；
设施黄瓜连作12 年的土样经鉴定初步得出5 属16 种，包括曲霉属、青霉属、串珠菌属、毛霉属和镰孢属。
图1 青霉属分生孢子及分生孢子梗
图2 曲霉属分生孢子及分生孢子梗
图3 根霉属菌落形态、假根及孢囊孢子
图4 串珠菌属菌落形态及分生孢子
图5 链格孢属菌落形态及分生孢子
图6 毛壳菌子囊壳及子囊孢子
图7 腐霉属菌落形态及孢子囊、菌丝
图8 壳色多隔孢属菌落形态及分生孢子
图9 镰孢属菌落形态及分生孢子
图10 地霉属菌落形态、菌丝及分生孢子
图11 枝孢属菌落形态及孢子
图12 毛霉属孢囊梗、菌丝及孢子囊
由表1 可看出，经过分离和初步形态学鉴定，在分离获得的大田土壤真菌类群中，地霉属、毛壳菌属、青霉属和无孢类群为优势种群，地霉属真菌数量最多，占大田土壤真菌总菌株数的40.00%，青霉属和毛壳菌属数量相差不大，其分离率分别为12.00%和13.33%；
轮枝孢属、毛霉属和链格孢属为亚优势种群，其余的为弱势种群。
表1 不同连作年限土壤真菌群落结构组成
与大田土壤真菌相比，设施黄瓜连作5 年的土壤中曲霉属和根霉属的种类和数量均有增加，总的真菌种类有所减少。其中曲霉属和无孢类群真菌为优势种群，分别占黄瓜连作5 年土壤总菌株数的43.75%和20.83%；
根霉属和轮枝孢属为亚优势种群，其分离率分别为11.46%和13.54%；
青霉属、链格孢属、腐霉属、地霉属和毛霉属真菌为弱势种群，其分离率分别为4.17%、3.13%、1.04%、1.04%和1.04%。
设施黄瓜连作12 年的土样中曲霉属和无孢类群真菌为优势种群，占黄瓜连作12 年土壤真菌总菌数的分离率分别为41.53%和46.61%；
青霉属真菌为亚优势种群，其分离率为8.47%，其余各属为弱势种群。
2.2 不同连作年限土壤真菌群落多样性分析
连作年限不同的黄瓜根际土壤真菌种群的多样性水平存在差异，如表2 所示。随着连作年限的增加，土壤真菌属水平种类逐渐减少，菌株数逐渐增加，某些真菌种群积累；
同样，随着连作年限的增加，土壤真菌群落的多样性指数（′）、均匀度指数（）和丰富度指数（）均逐渐降低，大田土壤多样性指数最高，其数值为1.85，均匀度指数和丰富度指数也是最高，其值分别为0.77、2.32。
表2 不同连作年限土壤真菌群落多样性
2.3 不同连作年限土壤真菌相似性分析
经过土壤真菌的分离鉴定，大田土壤真菌与设施黄瓜连作5 年的土壤真菌有3 种菌相同；
大田土壤真菌与设施黄瓜连作12 年的土壤有2 种真菌相同；
设施黄瓜连作5 年的土壤真菌与设施黄瓜连作12 年的土壤有2 种真菌相同。由Jaccard 相似性指数公式可得不同连作年限土壤的真菌群落相似性系数（表3）。
表3 不同连作年限土壤的真菌群落相似性系数
通过比较不同土壤真菌的发现大田和设施黄瓜连作5 年、设施黄瓜连作5 年和设施黄瓜连作12 年的相似性指数均在0.25～0.50，根据Jaccard 相似性系数原理，这两种为中等不相似；
而大田和设施黄瓜连作12 年的相似性指数在0～0.25，其为极不相似。可以看出两者之间连作年限越长，土壤真菌差别越大相似性越低。
设施连作栽培是现代农业生产中，尤其是专业化生产比较明显的地区或生产单位广泛应用的一种种植方式。长时间的连作会使土壤水分大量的消耗；
营养物质的不均衡消耗；
连作也会使植物体内积累有毒物质，产生自毒作用；
连作会导致作物病虫草害加重；
连作同样会导致土壤供肥能力的降低，以及导致土壤理化性质的改变。
土壤微生物结构稳定性和功能多样性对维持土壤系统健康有极其重要的作用，而土壤微生物结构和活性的稳定性取决于微生物多样性。本研究通过对设施黄瓜不同连作年限土样的分离鉴定，研究发现，随着连作年限的增加，真菌种类多样性逐渐降低，但是真菌总数量逐渐增加，这与连作对菠萝、植烟土壤微生物群落结构的影响结果相似。随着连作年限的增加，土壤中优势种群发生变化，曲霉属真菌逐渐成为优势种群，根霉属、镰孢属、轮枝孢属、链格孢属等病原菌数量逐渐增加，这与郑立伟等人研究结果一致。镰刀菌能够引起茎基腐病和枯萎病等病害，链格孢属真菌是引起植物叶枯病的主要病原菌等，对作物生产造成严重的损失。
综上所述，设施黄瓜长期连作的土壤中真菌种群产生了显著的影响。随着连作年限的增加，土壤中优势种群发生变化，病原微生物数目增加，逐渐成为优势种群，但土壤中真菌种类越来越少，多样性降低；
连作年限间隔期越长，两种土壤之间的相似性越低；
随着连作年限的增加，土壤真菌群落的多样性指数（′）逐渐降低，病原菌均匀度指数（）和丰富度指数（）逐渐增加，这与Liu Hang等研究结果基本一致。连作使病原菌种群数目富集，但有益真菌种群数目减少，连导致真菌种群平衡被破坏，植物根际微生态平衡被破坏，不利于作物的生长。
本研究通过对大田和设施黄瓜连作土壤真菌的分离鉴定，初步分析出了设施黄瓜连作对土壤真菌多样性的影响，对于指导设施黄瓜栽培地土壤多样性的生产和科学防治土传病害具有重要作用。
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