张颖 王萍1 李二娜 田晓春 陈鹏
摘 要：利用20对SSR引物分析48份籽用美洲南瓜种质的遗传多样性并建立指纹图谱，为籽用美洲南瓜种质的亲本选配、保护和鉴定提供依据。结果显示，这20对引物在48份籽用美洲南瓜种质中扩增出115条具有多态性的等位基因，位点的Shannon信息指数（I）均值为1.36、遗传多样性指数（H）均值为0.69、多态性信息指数（PIC）均值为0.63。聚类分析显示，20对SSR引物可将48份种质从0.659相似系数水平上分成两大类。其中，第Ⅰ类包含46份种质，在遗传相似系数为0.679处又将其分为3个亚类。第一亚类包含来自内蒙古巴彦淖尔市的15份种质和来自甘肃的18份种质，第二亚类包含来自新疆的10份种质，第三亚类包含来自山西的3份种质。第Ⅱ类包含了来自内蒙古呼伦贝尔市的2份种质。综合各项指标筛选出5对SSR核心引物將48份籽用美洲南瓜种质完全区分并构建了指纹图谱。
关键词：籽用美洲南瓜;SSR标记;指纹图谱;遗传多样性
中图分类号：S642.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）06-009-07
Genetic diversity analysis and SSR fingerprinting of seed-use pumpkin（Cucurbita pepo L.）germplasm
ZHANG Ying WANG Ping LI Erna TIAN Xiaochun CHEN Peng
（1. College of Horticulture and Plant Protection， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010000， Inner Mongolia， China; 2. Agricultural Reclamation Economic Development Office of Inner Mongolia Agricultural and Animal Husbandry Technology Extension Center， Hohhot 010000， Inner Mongolia， China）
Abstract：Twenty pairs of SSR polymorphic primers with good polymorphism and clear bands were used to analyze genetic diversity of 48 seed-use pumpkin （Cucurbita pepo L.） germplasm by fingerprinting for the purpose of parent selection， protection and identification. 115 polymorphic bands were amplified from the 48 pumpkin germplasm. The average Shannon’s information index （I） was 1.36， the average genetic diversity index （H） was 0.69， the average polymorphism information content （PIC） was 0.63. Cluster analysis showed that 48 accessions could be divided into two categories from the level of 0.659 similarity coefficient. The first category includes 46 accessions under three subclasses at the genetic similarity coefficient of 0.679. The first subclass has 15 accessions from Bayannur City， Inner Mongolia and 18 accessions from Gansu， the second subclass has 10 accessions from Xinjiang and the third subclass has 3 germplasms from Shanxi. The second category includes two accessions from Hulunbuir， Inner Mongolia. Five pairs of core SSR primers were selected based on diversity indexes. Forty-eight pumpkin germplasm were completely distinguished using fingerprinting based on the five core SSR primer pairs.
Key words：Cucurbita pepo L.; SSR markers; Fingerprints; Genetic diversity
籽用美洲南瓜俗称籽用西葫芦（Cucurbita pepo L.），为葫芦科（Cucurbitaceae）南瓜属（Cucurbita L.）草本植物，以种子作为主要食用器官。我国籽用美洲南瓜的生产主要集中在黑龙江、新疆和内蒙古三大产区，且出口量大，籽用美洲南瓜已成为重要的经济作物和深具特色的出口创汇型作物[1-3]。目前生产上优良籽用美洲南瓜种质资源较少，且重复使用少数种质资源作为亲本进行杂交育种，导致栽培种的遗传背景较窄，且大多数栽培种的病害抵抗力较差，严重限制了籽用美洲南瓜种育种材料的创新与利用[4-6]。此外，作物育种发展不充分不平衡问题，使得有限的研究成果难以在育种上得到充分应用，在优良品种选育方面的贡献率没有达到预期[7-8]。
伴随现代分子遗传育种技术的飞速发展，在基因水平上指导南瓜品种的改良、选育，是开展籽用美洲南瓜种质资源遗传多样性研究、加快育种进程的重要步骤[9]。其中SSR（simple sequence repeat）分子标记技术因具有多态性丰富、重复性好、等位变异频率高等优点，在植物的遗传多样性分析中得到了广泛应用[10-11]。迄今为止，已有很多学者通过应用SSR分子标记技术对南瓜属植物进行遗传多样性分析，王艳玲等[12]对南瓜属的3个主要栽培种（中国南瓜、美洲南瓜、印度南瓜）的亲缘关系进行分析，结果表明中国南瓜与美洲南瓜亲缘关系较为相近，而印度南瓜则单独在另一分支上，刘超[13]对76份籽用南瓜（籽用印度南瓜和籽用美洲南瓜）种质资源的遗传多样性进行研究，认为籽用南瓜的亲缘关系受其生态型及其来源地影响较大。全面系统地构建指纹图谱是快速厘清籽用美洲南瓜种质资源间的亲缘关系、提升亲本选配效率的重要举措[14-15]。目前，利用SSR 分子标记技术，对玉米、大豆、小麦、水稻等[16-19]主要农作物指纹图谱的研究较多，而籽用美洲南瓜在这方面的报道则很少见。笔者应用SSR分子标记技术对其48份种质的遗传多样性进行分析，并建立指纹图谱，以期为籽用美洲南瓜种质资源的保护和创新利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用48份籽用美洲南瓜种质材料由内蒙古农业大学园艺与植物保护学院籽用瓜课题组提供，均为通过多年多代自交选择获得的纯系材料，其主要农艺性状如表1所示。于2021年5月23日采用随机区组方式播种于内蒙古农业大学试验田，每个小区20株，3次重复。同年8月采集生长旺盛期的植物嫩叶，用液氮急冻，-80 ℃保存备用。
1.2 基因组DNA的提取及引物合成
48份供试材料的基因组DNA用试剂盒（天根生化有限公司）进行提取，提取的DNA样本通过1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量浓度，将DNA样本质量浓度稀释至30～50 ng·μL，-20 ℃保存备用。SSR标记共用引物50对，其序列从相关文献[20]中获得。所有引物均由上海生物工程技术公司合成。
1.3 引物筛选及PCR反应
以5份表型差异较为明显的种质材料对50对引物进行初筛，初筛后选择条带清晰、多态性好的22对引物用于48份种质的遗传多样性分析。PCR反应体系为10 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物共1 μL，Taq Mix 5 μL，ddHO 2 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预热变性3 min;94 ℃变性20 s，68 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，6个循环（退火温度每个循环降2 ℃）;94 ℃变性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，8个循环（退火温度每个循环降1 ℃）;94 ℃变性20 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20个循环;72 ℃延伸5 min。
1.4 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
扩增产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过硝酸银染色检测种质间的多态性。具体方法如下：30%丙烯酰胺21 mL，5×TBE buffer 14 mL，加蒸馏水定容至70 mL后加入10%的过硫酸铵700 μL溶液，配置70 mL的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，最后在使用前加入50 μL的TEMED。待胶凝固后，将其与电泳槽组装好，上下倒入1×TBE。在10 μL的PCR产物中加入2 μL的6×Loading Dye，混合均匀后进行点样，每孔1 μL。点样后接通电源，在175 V的电压下电泳120 min左右，银染后拍照记录。
1.5 数据处理
对扩增片段大小在250 bp以下的条带进行统计，用“1”和“0”两种数字来表示条带的分布情况，有条带的位置用“1”表示，没有条带的位置用“0”表示，以此来获得基础的0/1矩阵。通过POWERMARKER 3.0分析引物多态性信息含量（PIC），使用软件NTSYSPC2.10e对样品进行聚类分析，利用POPGEN32分析观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon信息指数（I）、遗传多样性指数（H）、期望杂合度（He）和观测杂合度（Ho）。
2 结果与分析
2.1 引物多态性分析
从50对引物中筛选出了多态性好、条带清晰明亮的20对引物对48份种质的基因组DNA进行PCR扩增，部分引物扩增效果如图1所示。20对引物共扩增出122条清晰可统计的条带，其中有115条多态性条带，多态性百分率为94.26%。由表2可知，在本研究的20对引物中，引物CMTp141的PIC值最高，为0.90;引物CMTp18的PIC值最低，为0.44。所有引物的PIC值均介于0.44～0.90之间，平均多态性信息含量为0.63。20对引物的Na值在3～13之间，平均为5.65。Ne值在2.05～10.32之间，平均为3.58。由此可见20对引物间的观测等位基因数与有效等位基因数有较大差异，说明等位基因在群体内存在分布不均的现象。20对引物的Ho值介于0.09～0.50之間，平均值为0.31。而He值介于0.52～0.91之间，平均为0.69，平均观测杂合度小于平均期望杂合度。20对引物的I值在0.88～2.45之间，均值为1.36。其H值在0.51～0.90之间，均值为0.69。综合以上各个指标，表明试验所用的48份种质材料具有较为丰富的遗传多样性。
2.2 籽用美洲南瓜种质遗传多样性分析
根据这48份种质的来源地将其分为5个群体，群体A包含来自内蒙古巴彦淖尔市的15份种质;群体B包含来自甘肃的18份种质;群体C包含来自新疆的10份种质;群体D包含来自山西的3份种质;群体E包含来自内蒙古呼伦贝尔市的2份种质。通过NTSYSPC2.10e软件对48份材料进行UPGMA聚类分析，其遗传相似系数介于0.31～0.98之间。由图2可知，48份种质中亲缘关系最近的是47和48，遗传相似系数为0.98。而亲缘关系最远的是6和18，遗传相似系数为0.31。在遗传相似系数为0.66水平处，可把这48份材料分成两大类。第Ⅰ类包含了46份种质，在遗传相似系数为0.68的水平上又分为3个亚类。第一亚类包含1、2、12等15份种质（属群体A）和3、28、25等18份种质（属群体B），第二亚类包含31、19、24等10份种质（属群体C），第三亚类包含33、35、37共3份种质（属群体D）。第Ⅱ类包含了17、18两份材料（属群体E）。
2.3 不同籽用美洲南瓜种质资源群体的遗传多样性分析
为进一步分析籽用美洲南瓜种质资源遗传多样性与其地域来源的关系以及不同区域籽用美洲南瓜种质资源的亲缘关系，对这5个群体的I值进行计算。由表3可知，5个群体的I值变化范围为0.68～1.30，综合各群体多样性指数（Na、Ne、I）的计算结果，5个群体的遗传多样性由低到高依次为群体E<群体D<群体A群<群体C<群体B，由此可见群体E遗传多样性相对较匮乏，群体B的遗传多样性相对较为丰富。
2.4 不同籽用美洲南瓜群体间的遗传一致度和遗传距离分析
由表4可知，依据5个群体的遗传距离（GD），其亲缘关系由远到近进行排序：群体E与群体D（0.46）>群体E与群体A（0.37）>群体E与群体C（0.30）>群体D与群体B（0.27）>群体D与群体A（0.26）>群体D与群体C（0.25）=群体E与群体B（0.25）>群体A与群体C（0.18）>群体C与群体B（0.16）>群体A与群体B（0.11）。这表明群体E与群体D的亲缘关系最远，它们之间的遗传一致度（GI）为0.63，遗传距离（GD）为0.46;群体A与群体B的种质的亲缘关系最近，它们之间的GI为0.90，GD为0.11。
2.5 指纹图谱的构建
综合多态性信息含量和基因频率的数值，再结合基因型数据，挑选出5对引物。由表5可知，将这5对引物按照CMTp141、CMTp26、CMTp120、CMTp265、CMTp41的顺序结合可将48份种质材料完全区分开。利用材料在这5对引物中扩增出的谱带信息构成“0/1”代码，使得每份种质材料都得到一个独一无二的编码，从而构成了这48份材料的数字指纹图谱，结合片段大小将它们绘制成图3所示的指纹图谱。
3 讨论与结论
通过对引物的遗传多样性分析，结果表明本试验选用20对引物，扩增出122条条带，其中，多态性条带115条，多态率94.26%，高于王洋洋[21]报道的同为SSR分子标记多态性92.36%和刘超[13]报道的SSR分子标记多态性85.89%，说明本试验所选用的引物具有较高的分辨率，能够区分亲缘关系较近的品种。研究中48份种质间的遗传相似系数变幅为0.31～0.98，说明这48份籽用美洲南瓜种质间存在较丰富的遗传多样性。在聚类分析图中遗传相似系数为0.66处，可以将48份种质分为两大类，第一类包含了来自内蒙古巴彦淖尔市、甘肃、山西及新疆的所有种质材料，而来自内蒙古呼伦贝尔市的种质材料则被单独聚为一类，由此可见，呼伦贝尔市的种质材料与其他4个地区的种质材料的亲缘关系相对较远。这与对这5个群体间的遗传距离和遗传相似系数的分析结果相一致。结合地理位置来看，呼伦贝尔种质被单独聚为一类可能是由于内蒙古巴彦淖尔市、新疆、山西及甘肃都属于中国的西北部，而内蒙古呼伦贝尔市更靠近中国的东北部，且相近地区的籽用美洲南瓜种质资源间存在频繁交流，因此，地理位置相近种质间的亲缘关系较为密切。由此可见，种质间的差异受其所处地理位置的影响较大，这与前人的结论较为一致[13，22]。
笔者采用引物组合法对供试材料进行了区分，陈世军等[23]曾用这种方法为60份黔南野生茶树构建了指纹图谱。由于不同引物鉴别能力存在差异，PIC值最高的引物CMTp141仅能区分28个样品，因此，按照PIC值最高的前4个引物对44份种质资源进行了区分。由于6和7、9和11之间的遗传相似系数较高，仅有极个别引物能够将其区分，因此，在符合要求的引物中选取PIC值最高的引物CMTp41对其进行区分。但试验筛选出的引物的鉴别能力低于陶爱芬等[24]利用88份南瓜种质（包含美洲南瓜、中国南瓜、印度南瓜）分析筛选出的可区分72份种质的引物E5EM8。分析原因，可能是试验所用材料生态类型较为单一，亲缘关系较近，难以通过较少的引物组合对大量种质进行完全区分。后续为了获取区分能力强的引物，可选择地理来源更加广泛、生态类型更加丰富的材料进行试验。本试验虽利用5对核心引物将48份种质完全区分，但随着籽用美洲南瓜的种质资源越来越丰富，这5对引物的鉴别能力也会逐渐下降，需要继续对来自不同地区籽用美洲南瓜的种质进行指纹图谱的构建，筛选出更多鉴别能力强的引物，进一步完善籽用美洲南瓜种质的指纹图谱。
利用筛选出的20对多态性引物对48份种质进行多样性分析，试验筛选出的20对多态性较高的引物（PIC≥0.4），可为后续研究提供可参考的引物材料;基于SSR分子标记进行聚类，48份种质被聚为5类，聚类结果与地理来源相一致，即同一地区种质被聚为一类，说明个体间亲缘关系与地理来源密切相关，与群体间遗传距离分析结果一致性较高;本试驗将5对核心引物（CMTp141、CMTp26、CMTp120、CMTp256、CMTp41）进行组合，将48份种质完全区分，进一步完善了籽用美洲南瓜种质的指纹图谱。
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