摘要：引起猪腹泻疾病的病因较多，病毒性腹泻是最严重的一个类型，它是由腹泻病毒引起的急性传染性的疾病。近年，猪流行性病毒腹泻在世界范围内爆发，为控制该病毒，研究人员建立病毒的靶向RNA重组技术、细菌培养技术、细菌人工染色载体系统等猪流行性腹泻病毒的遗传学研究技术，对猪流行性腹泻病毒的致病机理和疫苗开发有重要意义。该文总结了猪流行性腹泻病毒反向遗传操作技术研究现状及生产实践中的应用情况，为新型疫苗的研究提供参考。
关键词：猪流行性腹泻病毒;反向遗传学;疫苗研发
中图分类号：S858.28 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.21.064
Application Status of Reverse Genetic Manipulation of Porcine Epidemic Diarrhea Virus
Abstract：There are many causes of porcine diarrhea disease，and viral diarrhea is the most serious type.It is an acute infectious disease caused by diarrhea virus.In recent years，the swine epidemic virus diarrhea has broken out in the world，and there is no effective method to control the disease so far.To control the virus，researchers have developed targeted RNA recombination techniques，bacterial culture techniques，bacterial artificial stain vector systems，and other genetic research techniques for porcine epidemic diarrhea virus，it is of great significance to the pathogenesis and Vaccine Development of porcine epidemic diarrhea virus.In this paper，the research status of reverse genetic manipulation of porcine epidemic diarrhea virus and its application in production were summarized.
Keywords：porcine epidemic diarrhea virus，reverse genetics，vaccine development
引言
規模化养殖条件下猪的疫病控制较好，但因为有些疾病的关键药物和防治手段不明确，还存在大范围爆发的可能性。包括猪流行腹泻病毒、猪传染性肠胃炎病毒，2种病毒都属于冠状病毒科α冠状病毒属，是带有囊膜的正链RNA病毒。因为猪流行性腹泻病毒分链为28 kb，很难对其进行遗传学反向操作。对其进行研究时要对其遗传信息进行拷贝，但因为其具有毒性，在拷贝过程中不稳定。目前已成功开发3种猪流行性腹泻病毒的反向遗传学操作技术。
1 猪流行性腹泻病毒反向遗传学技术
1.1 同源重组技术
靶向同源RNA技术是现在应用较为普遍的分子技术，在重组鼠甘油病毒中首次使用该技术，并获得完整的感染病毒毒株。冠状病毒的同源RNA重组主要是利用了轻度的S蛋白的毒性作用，通过替换S蛋白合成基因的方式完成病毒的重组。建立冠状病毒的猪流行性腹泻病毒的反向操作技术，分2步完成病毒重组，先是构建鼠源的细胞嗜性的肝炎病毒基因的S蛋白基因的编译序列，在Vero细胞内进行重组获得重组猪流行性病毒腹泻病毒。第1步是选择构建供体质粒，选择噬菌体T7RNA聚合酶作为基因编码序列、orf1a/1b基因、鼠肝炎S蛋白细胞以外的编码序列与orf3、e、m、n基因的猪流行性腹泻病毒基因下游序列，将质粒体外转录获得的病毒转到Vero细胞内，利用LR7细胞筛选出病毒致病基因。第2步是构建包含同基因组区域、携带猪流行性腹泻病毒基因的第2个重组质粒，在质粒构建时可以根据病毒的研究方向，选择替换致病基因的序列或顺序。虽然使用同源重组技术可将病毒进行转录，但在转录中因为有些区域中含有终止复合酶，在进行转录中要先对病毒的终止信号进行鉴别。在进行重组中要对病毒的致病基因进行钝化，技术较为烦琐[1]。
1.2 载体反向遗传操作技术
根据猪流行性腹泻病毒基因组限制酶切位点的功能特点，将其分为8个片段，每个片段的两端均选择合适的限制性酶切位点进行内切，之后再利用脱氧核糖核酸（DNA）链将片段合成全长的长链DNA。该技术可以减少冠状病毒的毒性序列在拷贝质粒中复制的不稳定难题，可对病毒所有基因进行剪切整合操作，获得病毒具有高的表达效率。由于需要引入新的限制性酶切位点，需要认真分析和选择限制性酶，避免引入内切酶后引起突变影响病毒的复制而导致拯救病毒失败。
1.3 体外反向遗传学操作技术
体外反向遗传技术可避免细菌在细胞内增殖引起病毒的不稳定性，是抑制病毒毒性的最有效措施。按照体外连接的反向遗传学操作技术，先将体外病毒转移到长链的DNA链上，保证病毒基因的稳定，利用核糖核酸（RNA）聚合酶体对该病毒进行转录获得病毒基因组，再将含有致病基因的病毒组转移到细胞内进行病毒重组。首先利用这种体外组装技术，获得大片段的DNA并将冠状病毒感染性克隆，此技术还可在肝炎病毒、传染性支气管炎病毒、非典型肺炎病毒（SARS）、禽流感和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS）的反向遗传学操作中应用。
1.4 其他反向遗传学操作技术
除上文提到的同源重组技术、载体反向遗传操作技术、体外反向遗传学操作技术外，目前还有以痘病毒为载体的反向遗传技术、基于Gibson组装系统为基础的反向遗传技术。虽目前对这2种技术的研究还较少，但是均具有良好的发展前景，值得进行进一步的开发和应用。
2 技术应用现状
2.1 在猪流行性腹泻病毒的研究应用
应用反向遗传技术对猪流行性腹泻病毒进行研究后发现其对胰蛋白酶具有依赖性，采用反向遗传后发现S蛋白基因受到胰蛋白酶影响下发生空间构像的改变。在进一步研究中发现S蛋白基因中的T752位点是胰蛋白酶依赖点，这对于病毒体外扩增具有重要意义。
猪流行性腹泻病毒的主要毒力蛋白S，其具有不同的类型，使用反向基因学可以將这些不同类型的毒力蛋白因子进行剪切，为进一步对病毒的致病力研究提供参考。猪流行性腹泻病毒的猪圆环病毒3型（ORF3）蛋白是目前发现的唯一一个辅助性蛋白，应用反向遗传学技术ORF3蛋白可以使分析其他病毒蛋白细胞适应和致病性的影响与ORF3蛋白的影响结合起来成为可能[2]。
2.2 研制新型猪流行性腹泻疫苗
新生仔猪因为不能及时产生免疫应答能力，自身生产免疫抗原的能力有限，一般是依靠母乳获得免疫能力。实验证实猪流行性腹泻病毒具有直接侵袭小肠膜的能力，这种从母体获得免疫抗体的方式，可以有效控制病毒的侵害。在对母猪病毒腹泻抗原的体内变化监测中发现，母猪长期生活在固定环境下，体内会产生大量的病毒性腹泻抗原，这些抗原会通过乳汁供给仔猪，为仔猪提供免疫能力，但在母猪产后3 d左右免疫抗原的量会急速降低，抗原对仔猪的保护时间较短。猪病毒性腹泻疫苗主要是通过口服的方式，提高母猪乳汁的面向抗原量，减少仔猪腹泻的发生。
现在开发的口服疫苗的效果主要依赖疫苗对猪肠上皮细胞上的感染能力，然而猪流行性腹泻病毒在体外培养过程中影响它作为口服疫苗的病毒效力。通过Vero多代次培养后，Vero细胞适应毒株的能力相比猪流行性腹泻病毒Dr13亲本株培养的免疫疫苗效果差。Chen不同代数毒株培养制成的免疫疫苗，进行口服接种的毒力实验也证实多代细菌无法感染仔猪的小肠上皮细胞。为了开发有效的猪流行性病毒腹泻疫苗，接种的疫苗要保持其在体外的高生长性，还要保证毒力的同时必须保持病毒对小肠细胞的适应性。
猪流行性腹泻病毒反向遗传学操作及时给新型疫苗的研发提供巨大的潜力。为临床分离毒株和细胞适应株提供了技术保证，对重组病毒侵入猪小肠上皮细胞机制研究的不断深入，将进一步揭示消化道内的蛋白酶类对疫苗免疫的作用机制。利用反向遗传学技术改造体外培养的细胞以增加其小肠细胞适应性[3]。
3 结束语
猪病毒性腹泻的爆发给养殖业带来极大冲击，也对养殖者的效益产生极大损害。目前，反向遗传学技术的应用给研发新型疫苗提供了技术基础，以突变或抑制毒力基因表达的形式研制新型疫苗。但是，病毒在不同宿主体内的变异情况不同，其感染机制还不能清楚阐明，虽体外研究方式在一定程度上能解决该问题，但依据体外方式研发的技术类药品和疫苗在试验中的效价很低，有时会有诸多不良反应。反向遗传技术可以针对不同宿主进行病毒致病机理研究，为解决个体差异提供可行的技术手段。
参考文献
[1] 马玉腾，韩玉莹，金鑫，等.非洲猪瘟疫苗研究进展及其难点和突破点[J].中国预防兽医学报，2021，43（2）：219-225.
[2] 张金晶，王亚娟，丁翊君.多重聚合酶链反应结合反向线性点杂交技术检测新生儿化脓性脑膜炎的病原及其耐药基因[J].中华围产医学杂志，2019（11）：774-780.
[3] 郑海红，孙竹筠，张可煜，等.反向遗传学技术应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒研究的进展[J].中国预防兽医学报，2019，41（10）：1 072-1 076.
作者简介：王晓蕾（1984-），女，山东烟台人，本科，兽医师，从事畜牧兽医技术推广、重大动物疫病防控、动物及动物产品检疫、畜产品质量监督等工作。