【摘要】目的 应用Nogo—66 受体拮抗剂（sNgR1—Fc）对脑梗死大鼠进行治疗，观察其对梗死灶区域细胞轴突的保护及再生作用，并探讨其发挥作用的机制。方法 取SD大鼠15只，光化学法建立大脑皮层局灶缺血梗死（PCI）模型。设假手术组、PBS组和sNgR1—Fc治疗组，PBS组于侧脑室内注射PBS，sNgR1—Fc组则注射sNgR1—Fc。在PCI术后7 d，利用电镜观察各组梗死灶区域神经细胞轴突的形态学变化；Western blot技术检测梗死区细胞中RhoA，JNK及其下游的c—JUN、ATF—2蛋白的表达情况。结果 光化学法可以成功复制大脑皮层局灶缺血梗死模型。电镜下，在PCI后7 d，与假手术组比较，脑梗死组可见到严重的病变，无鞘纤维方面可见广泛的轴浆水肿或溶解、基质变淡；有鞘纤维方面可见广泛的髓鞘增厚或皱缩、板层紊乱，应用sNgR1—Fc处理后，上述现象均有明显改善。Western blot实验表明，在PBS组中，GTP—RhoA、p—JNK1、p—JNK2、p—c—JUN及p—ATF—2在较假手术组显著升高（ P 1—Fc处理后各因子的表达水平显著下降（ P 0.05）。结论 脑梗死发生后在较长的一段时间内都存在着显著的轴突损伤，这可能与激活RhoA/ROCK/JNK/c—Jun信号通路有关，并导致了轴突的再生受抑。而sNgR1—Fc则能有效地抑制这一通路，从而在一定程度上减轻轴突的损伤，并可能对促进轴突的再生发挥一定的作用。
【关键词】Nogo—66受体；脑梗死；轴突；再生；信号通路
The mechanism and protective effects of NgR1 antagonist on cortical axons after cortical infarction in rats LI Xin， CAI Jie， WEI Hong—yan， HU Chun—lin，JIN Xiao—li，ZHAN Hong，LIAO Xiao—xing. The First Affiliated Hospital of Sun Yat—Sen University， Guangzhou 510080， China
Corresponding author： LIAO Xiao—xing ，Email：liaowens@163.com
【Abstract】Objective To observe the protective effects of soluble Nogo—66 receptor （NgR1） antagonist （sNgR1—Fc） on cortical axons after cortical infarction in rats， and to study the phenomenon and molecular mechanism of its protective effects on and regeneration of axons. Methods The cortical infarction was induced by photochemistry， termed photothrombotic cortical injury （PCI）. Fifteen Sprague Dawley rats were randomly divided into three groups： Sham—operated group， PBS （phosphate buffered solution） group， and sNgR1—Fc group. In PBS group， PBS was injected into the lateral ventricle of rats； and in sNgR1—Fc group， sNgR1—Fc was injected instead of PBS. The ipsilateral cortex with lesion was harvested for histomorphometry and transmission electron microscope observation 7 days after PCI. Proteins including GTP—RhoA， p—JNK， p—c—JUN and p—ATF—2 were detected by Western blot， as well as Total—J and Total—RhoA. Results The cortical infarction in rats was successfully induced by photochemistry. Compared with sham—operated group， the pathological changes in PBS groups were more serious， including extensive edema or disappearance of axoplasm of fiber without medulla sheath involved and extensive thickening or layer derangement in axoplasm of fiber with medulla sheath involved. These changes were improved significantly after sNgR1—Fc treatment. The levels of GTP—RhoA， p—JNK1， p—JNK2， p—c—JUN and p—ATF—2 in the PBS group were significantly higher than those in the sham—operation group （ P 0.05）. The sNgR1—Fc treatment up—regulated the levels of these proteins （ P 1—Fc may inhibit this pathway significantly， and then promote the regeneration of axon partially. 【Key words】Nogo—66 receptor； Cortical infarction； Axon； Regeneration； Signal pathway
脑梗死又称缺血性脑卒中，是指由于大脑局部血液供应障碍，导致局部组织细胞缺血、缺氧，从而引起的局限性脑组织的缺血性坏死或脑软化。脑梗死具有高发病率、高病死率、高致残率及高复发率等特点。伴随着社会老龄化的趋势，脑梗死这一疾病愈显严重，是我国目前迫切需要解决的医疗问题之一。中枢神经系统损伤后，自身虽可以一定程度的修复，但是效果往往不良。个中原因众多，除了因为神经干细胞的数量不足外，更重要的是由于损伤局部微环境抑制神经元细胞的再生。现阶段研究表明，中枢神经系统损伤后的再生受抑源于一类对轴突生长起抑制作用的髓鞘蛋白，这类髓鞘蛋白包括Nogo—66，髓鞘结合糖蛋白（MAG）和少突胶质细胞—髓鞘糖蛋白（OMgp）。Nogo—66、MAG和OMgp结合神经元细胞膜上的Nogo—66受体（NgR1）后，通过两个跨膜式蛋白LINGO—1和p75进一步激活下游的RhoA（Ras homolog gene family， member A）而发挥抑制神经纤维生长的作用[1—3]。而存在于细胞内的JNK，是一种与应激刺激相关的因子，它的活化介导参与了各种损伤引致的细胞凋亡过程，在轴突的再生过程中也发挥了作用，但JNK信号通路的调控机制尚未研究清楚，尚需进一步的研究。sNgR1—Fc是由大鼠可溶性的NgR蛋白和Fc段链接组成的一种重组蛋白，这种蛋白可以有效地阻断髓鞘抑制蛋白和其受体NgR1的结合，从而促进轴突再生。因此，本研究拟复制脑梗死模型，研究急性脑梗死后中枢神经元的轴突损伤情况及其机制，并观察sNgR1—Fc的预防治疗作用，以便为将来的临床干预提供可靠的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
所有动物实验遵照1996版《美国实验动物使用指引》 （NIH Publications No. 80—23； http：//bbs.labscn.com/showtopic—30054.html） 的要求进行，并获得中山大学动物伦理委员会的批准。所有实验遵循随机和双盲的原则。
1.2 建立光化学法大脑皮层局灶缺血梗死模型
光化学法大脑皮层局灶缺血（ photothrombotic cortical injury， PCI）实验大鼠模型根据Watson等[4]的方法制作，局部细节稍有改动。选择体质量约250 g的雄性SD大鼠，腹腔内注射氯胺酮（ketamine，80 mg/kg） 和甲苯噻嗪（xylazine，8 mg/kg）进行麻醉。生理盐水稀释的玫瑰红（rose— bengal， 40 mg/kg）通过股静脉注入体内。在脑立体定位仪上固定动物，切开头皮暴露颅骨表面。把一根直径10 mm的光导纤维棒定位连接在颅骨前囟点后3 mm和中线向右旁开3 mm的交界点。光导纤维棒的另一端连接冷白光源（Volpi Intralux 6000， 150 W； Volpi AG， Schlieven， Switzerland） ，用最大输出功率照射8 min。实验过程中，用体温控制板（CMA 150； Carnegie Medicine， Stockholm， Sweden）监测并控制肛温在37 ℃。大鼠清醒后送入动物中心饲养，自由饮食。在本研究中提到的假手术组大鼠，除不注射玫瑰红外，其余所有操作同上。模型组的动物按照接受的处理不同，随机（随机数字法）分为PBS组和sNgR1—Fc 组。各组大鼠总数各为5只，1只用于组织染色检查，1只用于电镜检查，3只用于Western blot分析。
1.3 脑组织TTC染色
为鉴定制作局灶性脑梗死的有效性，对假手术组和脑梗死组的大鼠在PCI后24 h对梗死的脑组织进行染色显示。动物麻醉后断头取脑，放入—30 ℃冷冻10 min，自嗅球后2 mm作脑冠状切片，放入1% 2，3，5—triphenyltetrazoliumchloride （TTC） （Genetime） 生理盐水溶液中，37℃的恒温箱中孵育30 min，正常脑组织染成红色，缺血坏死的脑组织因线粒体被破坏不染色而成白色，取出脑片放至10%的福尔马林溶液中固定。
1.4 电镜检查
动物麻醉后断头取脑，0 ℃环境下迅速剥取梗死灶侧完整大脑皮层。在梗死灶周边位置切取0.5 cm3的组织块，固定于4%多聚甲醛4 h，4 ℃。用0.1 mol/L PBS液进行漂洗，2%锇酸后固定2 h，酒精丙酮梯度脱水后用812包埋剂包埋。超薄切片，常规铅铀染色，在日立HE—800透射电镜下观察。
1.5 Western blot分析
快速断颈处死动物、剥取梗死灶同侧新鲜大脑皮层，在梗死灶周边位置切取0.5 cm3的组织块，液氮冻存。收齐标本后，加入添加了10%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的裂解液 （10 mmol/L Tris pH 7.4， 150 mmol/L NaCl， 1 mmol/L EDTA， 1 mmol/L EGTA），冰浴下匀浆，将匀浆液入Eppendorf 5415D低温离心机中26 000×g在4 ℃离心30 min。取上清液，用Bio—Rad DC 蛋白质定量测定试剂盒（Bio—Rad Laboratories， CA，USA）在分光光度计上进行蛋白质定量测定。SDS PAGE采用4%积层胶，12%分离胶，上样量为40 μg，电压12 V/cm，结束后取出凝胶电转移至同等大小的硝酸纤维素膜上。转移后的硝酸纤维素膜置于封闭液（TBST+2%BSA+5%脱脂奶粉）封闭1 h。加入单克隆抗体（p—JNK1、p—JNK2、p—c—JUN、p—ATF—2、Total—JNK1、Total—JNK2；Cell Signaling Technology），4℃过夜。TBST漂洗5 min×3次；联有辣根过氧化物酶（HRP）的相应的Ⅱ抗（1∶500），室温处理1 h，TBST漂洗5 min×3次；增强化学发光法（enhanced chemiluminecence， Amersham）显示阳性反应的蛋白质。每条带的光亮度测定使用Image J分析。每个条带的蛋白负荷量用多克隆山羊 β—actin （1∶2000，C—11，Santa Cruz Biotechnology）检测控制。测定GTP—RHOA水平时，将样本和Rho活性分析试剂盒BK 036 （Cytoskeleton，CO，USA） 中的Rhoteckin—RBD 磁珠混合孵育离心洗涤后用裂解液重悬，上样做Western，其余步骤同上述。 1.6 统计学方法
数值以均数±标准差（ x±s ）表示。两组间的比较使用配对 t 检验，多组间的比较使用one—way analysis of variance （ANOVA） 和post—hoc tests （Student—Neuman—Keuls）。计算和分析使用SPSS 13.0完成。以 P 1—Fc组极少见到凋亡细胞、可见轻度的核水肿畸形、核仁完整存在；细胞器方面，可见较轻的线粒体肿胀、内质网轻度增宽、核糖体与高尔基体完整存在；无鞘轴突方面，可见轻度的轴浆水肿、轴突畸形、基质变淡、未见轴突融合与少突胶质细胞吞噬轴突现象（图2C）；有鞘轴突方面，脱髓鞘和髓鞘板层化现象明显较轻，形态大致正常，未见髓鞘淀粉样变性现象（图2F）。在突触方面，相比正常突触（图2G），PBS组突触间隙水肿、增宽（图2H），sNgR1—Fc组可见突触间隙无明显水肿、增宽，形态大致正常（图2I）。
2.3 sNgR1—Fc抑制RhoA信号通路的表达
脑梗死PBS处理组的GTP—RhoA水平显著高于假手术组（ P 1—Fc后，GTP—RhoA水平较PBS组显著降低，提示sNgR1—Fc可能一定程度上恢复了神经元轴突的再生功能。而Total—RhoA水平在两组间差异无统计学意义（ P >0.05）。见图3、表1。
2.4 sNgR1—Fc对蛋白激酶/Jun氨基端激酶信号通路的抑制
本研究中， p—JNK1、p—JNK2及其下游的p—c—JUN、p—ATF—2的水平较假手术组显著升高（ P 1—Fc处理后各因子的表达水平显著下降（ P 0.05）。这些结果表明脑梗死对SAPK/JNK途径有显著的活化作用，使用sNgR1—Fc处理后，上述因子的表达较PBS组明显下降（ P 1—Fc可能通过某种机制来抑制蛋白激酶/Jun氨基端激酶信号通路的活化。见图4、表1。
3 讨论
Watson等[4]于1985年首次报道了光化学法制作脑梗死模型，其原理是由注入动物体内的特定的光敏物质，在特定波长的光源照射下，诱发光化学反应，产生并释放活性氧自由基，导致血管内皮细胞损害，引发血小板聚集黏附形成血栓，导致血管闭塞，局部组织缺血缺氧，最终发生不可逆的缺血性脑损伤。这一模型因为具有可预知梗死的部位和范围、病死率低、重复性好等优点，因此在现阶段的研究中被广泛使用。本研究中，使用PCI法成功制成大脑皮层局灶缺血梗死模型，并伴有血脑屏障的破坏。每个梗死灶的大小基本一致，这为随后对药物治疗效果的比较提供了前提。在假手术组未见梗死灶，说明单纯的光照不会引起脑组织梗死，且不会导致烧伤等并发症，为实验的顺利进行提供了良好的对照。
迟发性神经元死亡与脑缺血、脑退行性病变等的关系密切。急性脑缺血缺氧性损伤后继发引起的细胞凋亡是迟发性神经元死亡的主要方式，是脑梗死后亚急性期和慢性期病变进一步加重的重要原因之一[5—6]。本研究中，PCI后7 d的透射电镜检查依然可以看到明显的轴突病变。与假手术组比较，脑梗死组可见无鞘轴突广泛的轴浆水肿、轴突畸形、基质变淡、轴突融合，个别可见少突胶质细胞吞噬轴突；有鞘轴突广泛的脱髓鞘和髓鞘板层化现象，轴突水肿、基质变淡、个别可见髓鞘淀粉样变性。而这些现象在使用了NgR1的拮抗剂sNgR1—Fc后的实验组中有明显改善，这表明sNgR1—Fc具有一定的轴突保护作用。因此，笔者推测，除了缺血缺氧和过度的炎症反应等导致轴突损伤的原因之外，髓鞘抑制蛋白（包括Nogo—66，MAG和OMgp）的增多也加重了这一损伤过程[7—8]。
神经元在损伤及缺血时发生可塑性变化的一个重要标志是神经元轴突的出芽和再生。缺血—再灌注12 h时，轴突就受到了一定程度的破坏，而到再灌注24 h时，轴突的破坏最为严重。在缺血早期，随着脑组织的缺血、变性及坏死，此时神经元内的各种蛋白质及神经递质的合成也相应的减少，同时轴突蛋白的表达也降低。而到了缺血后期，轴突蛋白表达开始逐渐升高，显微镜下观察到的的阳性轴突纤维也在逐渐增加，这表明轴突开始了再生过程。但糟糕的是，Nogo—66及其受体NgR1的表达也显著增高[9]。Nogo—66、MAG和OMgp被认为是髓鞘相关的神经再生抑制因子。NgR通过与p75和Lingo—1组成受体复合体而介导Nogo—66、MAG和OMgp的抑制作用。抑制因子与NgR结合后，信号通过p75传递给RhoA，RhoA再作用于下游的效应器ROCK，引起细胞内信号传递而对生长锥中的微丝进行调节，使生长锥溃变，抑制轴突再生[10—11]。在本研究中，PBS组的GTP—RhoA水平显著高于假手术组，表明轴突的生长受到一定程度的抑制。使用sNgR1—Fc后，GTP—RhoA水平较PBS组有显著降低，提示sNgR1—Fc可能在一定程度上恢复了神经元轴突的再生功能。 应激活化的蛋白激酶/Jun氨基端激酶（stress—activated protein kinase/Jun—amino— terminal kinase， SAPK/JNK）信号通路是（包括紫外线、辐射、神经酰胺、炎症因子等）影响机体的最强力信号途径之一[12—14]。近年研究神经元凋亡的热点之一是探讨多种丝裂素活化蛋白激酶（mitogen—activated protein kinases， MAPK）信号通路的作用。MAPK是一丝/苏氨酸蛋白激酶家族，由ERK、JNK和p38组成，每一成员都各自形成独立的信号通路及网络，介导胞外信号引起核反应信息传递的汇聚功能。JNK最初被命名为54 kD的SAPK，可被许多应激诱导刺激（ 如脂多糖、TNF、IL—1、渗透压应激和紫外线）所活化，JNK通路的激活与细胞凋亡关系密切。JNK激活通过对转录因子c—Jun /AP—1、ATF—2、Elk—1等磷酸化促进基因的表达及新蛋白质的合成，新生蛋白质可能作用于细胞凋亡途径的某一环节而促进细胞凋亡[15]。在本研究中，p—JNK以及其下游的p—c—JUN、p—ATF—2在PBS组较假手术组显著升高，表明SAPK/JNK信号通路被缺血损伤激活而进一步导致组织和细胞的病变。使用sNgR1—Fc处理后各因子的表达水平显著下降，表明sNgR1—Fc对SAPK/JNK途径有显著的抑制作用。由此可推断，sNgR1—Fc的这一作用也必然会带来减轻炎症损伤、较少细胞器的破坏、减少细胞凋亡等保护作用。
如上所述，RhoA能够以一系列复杂的分子信号通路来调节细胞内的微丝从而影响到细胞的再生，两种属于转录因子AP1家族中的c—fos和c—Jun因子也参与了这一过程。以往研究认为，RhoA主要是通过将信号传递给c—fos，从而影响肌动蛋白的聚合作用。然而Marinissen等[16]的研究表明，RhoA也可以通过ROCK（Rho associated kinase）来调节JNK的活性，从而调节c—Jun和ATF—2的表达。在本研究中，可以观察到p—JNK、p—c—Jun以及p—ATF—2的变化和GTP—RhoA的变化相一致。PBS组中，GTP—RhoA与p—JNK、p—c—Jun及p—ATF—2的表达均增加，而加入sNgR1—Fc后，表达均下降。据此，笔者推测Nogo—66结合NgR1后是可能会通过激活RhoA/ROCK/JNK/c—Jun这一信号通路来抑制轴突的生长，而sNgR1—Fc则能抑制该通路的激活，从而产生一定程度的轴突保护及再生作用。
本研究认为髓鞘抑制蛋白可能会通过激活RhoA/ROCK/JNK/c—Jun这一信号通路从而影响轴突的生长。然而考虑到在本研究中，只使用了sNgR1—Fc一种拮抗剂来进行研究，而没有使用诸如ROCK等其他信号分子的激动剂或拮抗剂，因此有必要再进一步的深入研究，得出更加确实可靠的结论，为今后的临床干预提供可靠的依据。
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（收稿日期：2012—06—19）
（本文编辑：郑辛甜）
DOI：10.3760/cma.j.issn.1671—0282.2012.09.015
基金项目：国家重点专科建设项目；国家自然科学基金 （81071030）； 广东省科技计划项目（2010B031600089）； 中大青年培育项目（ 09ykpy31）
作者单位：510080 广州，中山大学附属第一医院急诊科
通信作者，廖晓星，Email： liaowens@163.com
中华急诊医学杂志2012年9月第21卷第9期Chin J Emerg Med，September 2012，Vol.21，No.9
P981—986
