[摘要] 目的 建立一套基于非参数统计原理的评估方案，用于空白标本检测结果为非正态分布、标准曲线为非直线线性的检测体系最低检出限（limit of detection，LoD）的确定。 方法 根据数据分布模型，以非参数统计方法确定空白标本检测结果的第95百分位数作为空白检测限（limit of blank，LoB），通过LoD=LoB+tβ×s低值的数学模型来评估LoD。 结果 以非参数统计方法建立的评估程序可通过验证程序证明该LoD值有效。 结论 对于空白标本检测结果不符合正态分布，标准曲线为非直线线性的资料可用非参数统计的评估方法来确定LoD。
[关键词] 最低检出限；非参数统计；非正态分布
[中图分类号] R311 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）28-0108-03
根据国际标准化机构（ISO）要求，在确定检测体系的最低检出限（LoD）时尽量避免Ⅰ（α）类和Ⅱ（β）类统计学错误的发生[1-4]，ISO制定的一系列评估方案已考虑到这一问题，但都基于参数统计原理设计[5，6]，只适用于空白标本测定结果符合正态分布、标准曲线为直线线性的检测体系LoD的确定。但实际工作中有些仪器不报告吸光度、荧光强度等原始响应量，对于小于零的拟合结果直接报告为零或较小的正值，导致空白标本的检测结果不符合正态分布规则。此外，很多定量检测项目特别是基于抗原-抗体反应原理的检测方法，标准曲线并不符合一元一次直线线性[2，5，7]，而是复杂的曲线线性。针对以上不适合采用参数统计方法评估检测体系LoD的情况，应建立一种新的采用非参数统计原理设计的LoD评估方案来确定检测体系的LoD。
1 参数统计方法的理论基础及应用局限
理论上，空白标本由于不含有待测物，其真实浓度（μβ）为零，但由于空白响应量并不是一个固定值，其波动服从正态分布规律，因此对空白标本进行多次检测所得到的检测结果并不总是等于零。以均值（x）和标准偏差（S）表示空白响应量的集中位置和离散程度，单次检测的空白响应量有95%的概率分布在区间[x-2·s，x+2·s]内。在确定方法学性能或绘制标准曲线时常常以x作为校准至零点的基准，其对应的待测物浓度（x空白）定为零。各个检测样品的反应响应量减去x就是该标本中待测物产生的响应量，结合标准曲线计算出待测物浓度。由于空白响应量有波动，因此空白标本的检测结果应对称分布在x空白的两侧，大于0和小于0的概率都是50%，符合正态分布规则，空白标本单次检测结果有95%的概率在区间[x空白-2·s空白，x空白+2·s空白]内，在此区间外的概率只有5%。以该区间的上限值（x空白+2·s空白）作为空白检测限（limit of blank，LoB），只有检测结果高于LoB时才认为标本中确实含有待测物。对于小于或等于LoB的检测结果认为是由空白标本单次检测的空白响应量波动造成，可报告“无分析物检出”。但部分仪器无法给出原始响应量，而是直接报告检测结果，并将负值结果自动转换为零或者指定的检测低限，无法给出负值的检测结果。从医学角度分析，患者血清或其他体液标本中某待测物的含量不可能为负值，仪器对负值结果的转化是合理的，但这种偏态分布资料不适合采用参数统计方法通过x空白和s空白来确定该检测体系的LoB[8，9]。否则得到的LoB要明显大于真实的LoB[8]，从而导致很大一部分低浓度标本被误判为阴性，而出现“假阴性”的报告。
2 非参数统计方法的理论基础
2.1 Ⅰ类错误与LoD的关系
2.2 Ⅱ类错误与LoD的关系
3 非参数统计的评估程序
3.1 空白标本和低值标本的纳入标准
空白标本的物理性状和基质成分应尽可能接近患者标本，如果患者常规标本为血清或血浆标本，则应选择不含待测物的血清或血浆标本作为空白标本而不是非血清基质的缓冲液。由于不同来源的标本可能存在不同的基质效应以及形成不同的内源性复合物，为确保评估过程中的检测具有代表性，应选择多份空白标本（建议5～10份甚至更多），每份标本多次测定。低浓度标本也同样采用一系列（至少5～10例）不同患者来源的血清/血浆标本，每份标本进行5～10次重复测定，连续检测5～10 d，得到低浓度标本检测结果的标准偏差（s低值）。
3.2样本量的选择
评估程序中，空白标本数量和低值标本数量的最佳比例的选择取决于LoB估计值（LoB估计）和低值标本检测结果的离散度估计的不确定性。统计学上非参数统计方法的效率要低于参数统计方法，其检验效率只有参数统计的一半左右，因此用非参数统计的方法计算P95·空白时，建议空白标本的数量应该大于低值标本的数量。但低值标本检测结果的离散程度（s低值）要明显大于空白标本检测结果的离散程度（s空白）。因此综合以上两个因素，建议空白标本和低值标本的检测次数一样或至少接近[8]。而且理论上通过增加空白标本和低值标本的重复检测次数可以扩大样本量，减少抽样误差，使样本更好地反映总体。但实际工作中不可能对标本进行无限次重复检测，一般要求做20次或20次以上的重复测定，降低P95·空白和s低值来分别估计LoB和σs所带来的不确定性。
3.3 LoB和LoD的评估
由于是从有限例数的样本信息中推断总体特征，因此在LoD的评估过程中还要考虑到估值的不确定性，LoD估计的不确定性由LoB估计和s低值的不确定性共同构成。空白标本重复检测次数（nB）不同，LoB的95%的可信限（Confidence Interval，CI）也不同，当50≤nB≤300时，可通过LoB的可信限界值表来查得LoB的80%和95%的可信限[10]。例如当nB=50，LoB有95%的概率落入第（n-5）位数到第n位数这一区间内（所有的检测结果按照从小到大顺序排列）。s低值估值80%和95%的可信限的界限值通过其公差因数表查得。 在实际的评估过程中，我们只能根据已有的资料或经验粗略地估计LoD可能的存在范围，配置该浓度水平的低值标本并重复测定，根据该浓度水平下检测结果的s低值来计算LoD估计。Linnet[8]认为：对于含有不同待测物水平的低值标本，其检测结果的离散程度有差异，随着标本浓度的增加，检测结果的离散度同时增加。但两个低值标本的待测物浓度相差较小时，两组检测结果的离散度可认为是相当的。因此处理程序就相对简单，否则还要将标准偏差考虑成一个随样本浓度变化而变化的函数，那将会是一个非常复杂的处理程序。
3.4 LoD估计或LoD理论的验证
根据以上点估计的方法得到的LoD估计难以和LoD真值完全一致，因此必须对LoD估计的有效性进行检验。此外，很多实验室的现有条件可能难以建立一个适合本实验室使用的LoD，那么就要对制造商提供的理论LoD（LoD理论）进行有效性检验，评价其是否适用于本实验室的检测体系。一套完整的LoD估计或LoD理论验证程序包括：①对一份或多份空白标本进行nB次重复检测后，计算P95·空白，作为本实验室检测体系的LoB估计；②在空白标本中加入标准品，使标本中的待测物浓度达到LoD估计或LoD理论水平，观察检测结果中大于LoB估计的部分在所有检测结果中所占的比例（P），P≥95%时认为LoD估计或LoD理论是有效的。考虑到以样本代替总体时，会发生抽样误差，因此对于n0”或者“检到某物质”，因为这样我们可以避开统计学I类错误（α类错误）的发生，尽管发生此类错误的概率低于5%。
对于待测物水平等于或略高于LoD的标本的检测结果，其相对不确定度往往会很大，一般来说这种数据不应直接报告给临床。对于每个定量检测的项目还应该设立其相应的定量限 （Limit of Quantitation，LoQ），以规范定量检测结果的报告，这一界限值（LoQ）和实验室能接受的相对不精密度（CV）有关。在实验室的操作规程和文件中，每个项目的LoQ都应明确规定，例如在CV为10%或20%时，各自对应的LoQ是多少。应该充分考虑在这一浓度水平的检测结果可能存在的偏倚，以便计算出其相应的LoQ，使定量检测项目的检测结果能够准确报告。为了保证检验结果报告的科学性，当检验结果≤LoB时，可报告“未检出待测物”或“待测物浓度
[1] International Organization for Standardization. Capability of detection-part 1：terms and definitions（11843-1）1997 ISO Geneva，Switzerland.
[2] International Organization for Standardization. Capability of detection-part 2：methodology in the linear calibration case（11843-2）2000 ISO Geneva，Switzerland.
[3] International Organization for Standardization. Capability of detection-part 3：methodology for determination of the critical value for the response variable when no calibration data are used（11843-3）2001 ISO Geneva，Switzerland.
[4] International Organization for Standardization. Capability of detection-part 4：methodology for comparing the minimum detectable value with a given value（11843-4）2001 ISO Geneva， Switzerland.
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（收稿日期：2012-05-07）
