摘要 以1%转基因玉米MON810粉末为材料，对比了酚-三氯甲烷法、PVP法、CTAB法、胍-三氯甲烷法4种经过调整和优化的DNA提取方法在转基因玉米检测中的效果差别，该4种方法均能获得可供进行进一步转基因成分检测分析的DNA，其中CTAB提取法获得的DNA质量相对较高。DNA提取过程中，略去蛋白酶、淀粉酶以及RNA酶的使用步骤，同样可获得质量良好的DNA用于转基因成分检测分析。在转基因玉米检测中，可针对样品情况选择和优化方法。
关键词 转基因玉米检测；DNA提取；酚-三氯甲烷法；PVP法；CTAB法；胍-三氯甲烷法
中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）12-0052-02
DNA的提取过程中，对来源于植物的样品，要根据不同特点选择不同方法，或对方法进行调整优化[1]。转基因成分检测中，用于玉米或粗加工玉米产品的DNA提取方法很多[2]。该文对4种适合于未经加工或粗加工玉米类产品的核酸提取纯化方法进行调整优化和比较，以选择和建立一种高效快捷的用于玉米粗加工产品转基因检测核酸提取方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验中所用的材料为1%转基因玉米MON810粉末，购自欧洲标准局（IRMM）。
1.2 试验方法
采用酚-三氯甲烷法、PVP法、CTAB法、胍-三氯甲烷法4种方法，对试验材料进行DNA提取。不同方法所用样品量均为0.1 g。每种方法设置1个平行对照。分别分装于编号的2 mL离心管备用。
1.2.1 酚-三氯甲烷法提取DNA。向A、A1离心管中加入700 μL缓冲液（0.05 mol/L Tris，0.05 mol/L K2EDTA，30 g/L SDS，pH值8.0），65 ℃水浴30 min，期间混匀2次；加入等体积的Tris饱和酚，混匀，12 000 g离心5 min，取上清液；再依次用Tris饱和酚-三氯甲烷-异戊醇（25∶24∶1）、三氯甲烷-异戊醇（24∶1）重复上个步骤；上清液中加入0.6倍体积的异丙醇， -20 ℃沉淀20 min；4 ℃冷冻离心机中12 000 g离心2 min，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次，干燥；加入50 μL TE（pH值8.0）溶解得到DNA储备液A、A1。
1.2.2 PVP法提取DNA。向B、B1离心管加入700 μL缓冲液（0.2 mol/L Tris，0.250 mol/L NaCl，0.025 mol/L Na2EDTA，50 g/L SDS，pH值8.0），65 ℃水浴30 min，期间混匀多次；加入20 mg PVP粉末和0.5倍体积的乙酸氨溶液（7.5 mol/L），混合均匀，-20 ℃放置20 min；10 000 g离心10 min，取上清液；上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，-20 ℃沉淀20 min；4 ℃冷冻离心机中12 000 g离心2 min，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次，干燥；加入50 μL TE（pH值8.0）溶解得到DNA储备液B、B1。
1.2.3 CTAB法提取DNA。向C、C1离心管加入700 μL含2% β-巯基乙醇的CTAB-1缓冲液（0.02 g/mL CTAB，0.081 9 g/mL NaCl，0.007 5 g/mL Na2EDTA，0.012 1 g/mL Tris，0.02 g/mL PVP-40，pH值8.0），65 ℃水浴30 min，期间混匀2次；加入700 μL三氯甲烷-异戊醇（24∶1）混匀，12 000 g离心3 min，取上清液；加0.6倍体积异丙醇沉淀，-20 ℃沉淀5 min，4 ℃冷冻离心机中12 000 g离心2 min，弃上清液；70%乙醇洗涤沉淀1次；加入700 μL NaCl溶液（1.2 mol/L），65 ℃水浴10 min，加入Tris饱和酚-三氯甲烷-异戊醇（25∶24∶1）混匀，12 000 g离心5 min，取上清液；上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，-20 ℃沉淀20 min；4 ℃冷冻离心机中12 000 g离心2 min，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次，干燥；加入50 μL TE（pH值8.0）溶解得到DNA储备液C、C1。
1.2.4 胍-三氯甲烷法提取DNA。向D、D1离心管加入700 μL提取缓冲液（0.1 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，0.05 mol/L Na2EDTA，10 g/L SDS，pH值8.0），65 ℃水浴30 min；加入0.1倍体积的盐酸胍溶液（5 mol/L），混匀，65 ℃继续水浴30 min，期间混匀3次；加入等体积的三氯甲烷，混匀，12 000 g离心3 min，取上清液；上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，-20 ℃沉淀20 min；4 ℃冷冻离心机中12 000 g离心2 min，弃上清液，70%乙醇洗涤沉淀2次，干燥；加入50μL TE（pH值8.0）溶解得到DNA储备液D、D1。
1.3 DNA质量的检测
取1 μL DNA样品溶液，用超微量紫外分光光度计Nano Drop ND1 000进行检测和定量，检测结果如表1所示。可以看出，测得DNA储备液浓度，取适量体积DNA储备液稀释成浓度为25 ng/μL的PCR反应工作液。并采用质量分数为0.8%的琼脂糖凝胶对所提取的DNA进行电泳检测，EB染色后上凝胶成像仪上观察DNA分子的大小、完整性和电泳条带的清晰度，并拍照，获得凝胶图谱。
1.4 zSSⅡb基因的PCR检测
1.4.1 目标引物。采用转基因检测中玉米物种特异性检测方法对所提取DNA进行PCR扩增。玉米（Zea mays）物种特异性单拷贝淀粉合成酶基因（zSSⅡb）在转基因成分检测中作为玉米内标基因[3]。zSSⅡb序列：上游引物：5’-CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C-3’，下游引物：5’-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG -3’。目标片段大小为151 bp。 1.4.2 PCR反应体系。25 μL反应体系各成分终浓度：1×PCR缓冲液（不含氯化镁），1.5 mmol/L 氯化镁溶液，0.8 mmol/L dNTP溶液，0.2 μmol/L 上、下游引物，Taq酶0.5 IU，2 ng/μL样品DNA，以灭菌ddH2O补充至25 μL反应体系。
1.4.3 PCR反应条件。预变性95 ℃、10 min→PCR反应40个循环：95 ℃、20 s，60 ℃、40 s，72 ℃、40 s→最终延伸72 ℃、3 min。
1.4.4 PCR产物凝胶电泳。取反应产物6 μL用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，经EB染色后上凝胶成像仪观察拍照，获得凝胶图谱。
2 结果与分析
2.1 DNA样品的紫外分析
从外观上看，4种方法提取的DNA均呈现乳白色或无色。而4种DNA提取方法获得的DNA均可提出样品DNA，样品DNA的A260/A280比值均大于1.8，A260/A230的比值比A260/A280的比值偏低，DNA紫外峰吸收峰如图1所示。样品DNA的紫外光吸收曲线在A230的光吸收未在峰图低谷，表明有RNA残留。
2.2 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳分析
如图2所示，4种方法所提DNA均无大范围明显拖尾，说明DNA完整性较好。胍-三氯甲烷法和酚-三氯甲烷法泳道中目标条带稍有弥散，而PVP法和CTAB法泳道比较干净，且条带相对整齐、清晰，说明DNA质量好。尤其CTAB法，2个平行提取的DNA质量均很好。因DNA在260 nm处有很强的光吸收，蛋白质残留只有在比较高的水平才会使A260/A280的比值发生明显变化[4]，故虽然A260/A280比值相对趋于正常，但是图中点样孔仍然有发亮条带，表明有蛋白质等大分子物质残留。电泳图也显示有RNA残留，和紫外分析结果吻合。
2.3 玉米zSSⅡb内标基因的PCR检测结果分析
1%转基因玉米MON810粉末的zSSⅡb内标基因的PCR扩增结果如图3所示，4种提取方法获得的DNA，经过PCR扩增反应后，均能在凝胶电泳中检测到大小为151 bp的目标产物，说明样品DNA溶液中含有来源于玉米的可扩增的DNA，可用于进一步的转基因成分检测分析[3]。
3 结论与讨论
在转基因成分检测中，当所提取的DNA中十二烷基磺酸钠（SDS）或酚的残留达到一定浓度时，会彻底抑制PCR反应的进行[5]，4种DNA提取方法均用到了有机试剂酚，其中酚-三氯甲烷法、PVP法和酚-三氯甲烷法用到了SDS，在DNA提取纯化过程中应特别注意。转基因玉米检测中，获取高质量的DNA是检测结果准确的前提。试验结果表明，4种经过调整优化的DNA提取方法均能获得质量良好且可用于后续转基因检测分析的DNA。4种DNA提取方法虽然有蛋白质、RNA等残留，但是样品DNA经过稀释定容，对PCR扩增的结果几乎没有影响。由此说明，在针对玉米及粗加工产品的DNA提取过程中，略去蛋白酶、淀粉酶以及RNA酶的使用步骤，同样可获得质量良好的DNA用于转基因成分检测分析。为了确保检测结果的准确性，应尽可能得到高纯度的DNA，在DNA提取纯化过程应针对样品本身的情况，选择使用合理的方法，合理提取和纯化条件优化配置。
4 参考文献
[1] CSAIKL U M，BASTIAN H，BRETTSCHNEIDER R，et al.Comparative analysis of different DNA extraction protocols：a fast，universal maxi-preparation of high quality plant DNA for genetic evaluation and phylo-genetic studies[J].Plant Molecular Biology Reporter，1998，16（1）：69-86.
[2] 国家质量监督检验检疫总局.GB/T19495.3-2004转基因产品检测 核酸提取纯化方法[S].北京：中国标准出版社，2004．
[3] 国家质量监督检验检疫总局.GB/T19495.4-2004转基因产品检测 核酸定性PCR检测方法[S].北京：中国标准出版社，2004．
[4] 萨姆布鲁克 J，拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].3版.黄培唐，王嘉玺，朱厚础，等译.北京：科学出版社，2002：45.
[5] 宋君，牛蓓，王东.两种蛋白质变性剂在转基因成分检测中的抑制作用[J].西南农业学报，2010，23（5）：1170-1172.
