摘要：为降低怀地黄（Rehmannia glutinosa f. hueichingensis）试管苗的生产成本，比较了封口膜与蘑菇袋、蔗糖培养与无糖培养、添加谷氨酸（Glu）培养与无Glu培养对怀地黄试管苗生长发育的影响。结果表明，蔗糖对试管苗的生长发育有极显著影响，蔗糖培养明显优于无糖培养；而封口材料与Glu仅对个别指标有显著影响，对怀地黄试管苗的整体生长发育情况无显著影响。所以，可以用蘑菇袋代替封口膜作为封口材料，但不能通过添加Glu用无糖培养代替有糖培养。
关键词：怀地黄（Rehmannia glutinosa f. hueichingensis）；试管苗；封口材料；蔗糖；谷氨酸；生长发育
中图分类号：S567.23+4；S723.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）21-4905-03
Effects of Closures，Sucrose and Glu on the Growth and Development of
Rehmannia glutinosa f. hueichingensis Plantlets
DU Lin，REN Guo-yan，LI Xin，FAN Jin-ling
（Food and Bioengineering College， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023，Henan，China）
Abstract： In order to decrease the production costs of Rehmannia glutinosa f. hueichingensis plantlets， the effects of seal film and mushroom bag， sucrose and sucrose-free culture， Glu and Glu-free culture on the growth and development of plantlets were compared. The result showed that sucrose had significant effect on growth and development of plantlets as sucrose culture surpassed sucrose-free culture obviously. Meanwhile， closure and Glu had no remarkable effect on the growth and development of plantlets except for few indexes. It was feasible replacing seal film with mushroom bag， while surose culture could not be replaced by Glu culture.
Key words： Rehmannia glutinosa f. hueichingensis； plantlets； closures； sucrose； Glu； growth and development
怀地黄[Rehmannia glutinosa f. hueichingensis （Chan et Sehih） Hsiao]为玄参科药用草本植物，是中国著名的“四大怀药”之一。但因在生产中长期采用营养繁殖，易受多种病害尤其是病毒病的侵袭，导致其品种退化，品质下降[1]。对于地黄病毒病的防治至今还没有特效药物，通过组织培养技术获得脱毒苗是目前解决地黄病毒病的最佳途径[2]，但通过组培快繁脱毒苗存在易污染且生产成本较高等问题[3]，如何降低生产成本就成为怀地黄脱毒苗规模化生产中一个亟待解决的重要问题。为此，本研究探讨了封口材料、蔗糖和Glu对怀地黄试管苗生长发育的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
怀地黄“85-5”试管苗来源于焦作市温县农科所，河南科技大学食品与生物工程学院生物化学与分子生物学实验室经无菌处理后继代培养。
1.2 方法
采用完全随机区组设计考察怀地黄试管苗在快繁过程中封口材料、蔗糖和谷氨酸3个因素对其生长的影响，因素与水平组合见表1。
快速繁殖的培养基为MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.02 mg/L，冷凝脂浓度为0.6%，按表1的处理加入蔗糖及Glu，调pH为6.0，并在121 ℃、1.1 kg/cm2的压力下灭菌。将无菌苗切成长2.5～3.0 cm的带芽茎段，称量鲜重后分别接种在培养基上；每组接种3瓶，每瓶接种6株。在温度（25±2） ℃、光照度2 000 lx、光照时间14 h/d的条件下进行培养。定期观察记录并于28 d时称其鲜重，然后于106 ℃、5 h烘干，称干重。
1.3 叶绿素含量的测定
采用丙酮—无水乙醇浸提法[4]。实验数据采用SPSS软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 怀地黄试管苗的形态发育情况
完全随机区组试验中各处理试管苗的形态发育情况见表2。由表2可知，有糖培养的1、2、5、6组生长情况要明显优于无糖培养的处理组，前者的腋芽萌发时间较早，芽生长较快，萌发率高，叶色浓绿，而后者腋芽萌发时间晚，芽生长缓慢，叶片发黄，萌发率低；且有糖培养可有效地促进试管苗根的生长，而无糖培养中根的生长情况较差。此外，使用透气性较好的封口膜的处理组在叶片数、腋芽萌发率、平均根数和平均根长4项指标上略好于透气性较差的蘑菇袋处理组；而Glu对各处理组形态发育的影响不明显。
2.2 怀地黄试管苗的叶绿素含量 初始培养时及培养28 d后怀地黄试管苗的叶绿素含量测定结果见图1。由图1可知，添加蔗糖的处理组其叶绿素含量均高于初始培养时的，未添加蔗糖的处理组培养28 d后叶绿素含量均低于初始培养时，说明无糖培养不利于其叶绿素含量的增加；而添加Glu的处理叶绿素含量均明显高于未添加Glu的，说明Glu有利于叶绿素的合成。
2.3 怀地黄试管苗鲜重和干重
由表3可知，添加蔗糖的试管苗的干重和鲜重增加值均明显高于未添加蔗糖的；而未添加蔗糖的试管苗其鲜重基本不增加。添加了Glu的处理组鲜重增量和干重也均高于无Glu的处理组，说明Glu对于试管苗的质量增加较为有利。而封口材料对试管苗质量的影响没有一定的规律。其中蘑菇袋、添加蔗糖和Glu的处理其鲜重增加值和干重均明显高于其他处理。
2.4 方差分析结果
对各因素对怀地黄各项指标的影响进行方差分析，F值见表4。由表4可知，蔗糖对各指标的影响均为显著或极显著；Glu仅对叶绿素含量的影响达到了极显著水平，其他均无显著影响；封口材料对试管苗的根数、根长及叶绿素含量的影响达到显著或极显著水平，而对其他指标无显著影响，但这3项指标对试管苗的快速繁殖阶段影响不大。因此，封口材料的差异以及Glu添加与否对怀地黄试管苗的生长影响不大；而蔗糖对试管苗的生长起到了至关重要的作用。
3 讨论与小结
3.1 封口材料
封口膜是组织培养中常用的封口材料，由于其中心有可透气的微孔滤膜，可以保证在无菌的情况下进行气体交换，封口膜的价格是0.1元/张；蘑菇袋又叫食用菌栽培袋，一般由聚乙烯或聚丙烯制作而成，密封性较好而透气性较差，但价格非常便宜，约0.002 2元/张。封口膜对怀地黄试管苗根部的生长有显著的促进作用，这可能是由于良好的透气性有利于试管苗根的形成与生长。这与廖飞雄等[5]的研究结果一致。但是封口材料对试管苗的冠部生长并没有显著性影响，因此，在怀地黄试管苗的快繁阶段可以考虑用蘑菇袋代替封口膜。
3.2 蔗糖
在一些植物的组织培养尤其是生根培养中，可以用无糖培养代替有糖培养[6-8]，但无糖培养过程中不同的植物种类甚至同类植物不同品种之间也存在较大差异[9]。本研究发现，怀地黄试管苗在无糖培养情况下生长几乎停滞甚至死亡，因此，在怀地黄试管苗的组培快繁中不能简单地用无糖培养代替有糖培养。
3.3 Glu
Glu是叶绿素合成的前体物质，可以促进叶绿素的合成，使叶绿素含量增加，从而使试管苗在进行异养生长的同时也能进行一定的光合自养，有利于干物质的增加。阎青云[10]研究发现低浓度的Glu能够增加荔枝的叶绿素含量、干物质及光合速率。本研究发现，适量Glu（5 mg/L）的添加有利于叶绿素含量的增加，干物质的积累也有所增加，但是未达到显著水平。因此，依靠添加Glu用无糖培养替代有糖培养未能实现。
综上所述，在怀地黄试管苗工厂化生产过程中，不能通过添加Glu用无糖培养代替有糖培养，但可以用蘑菇袋代替封口膜，从而节约生产成本。
参考文献：
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[10] 阎青云.新型植物生长调节剂L-谷氨酸对荔枝的生理效应[D].武汉：华中农业大学，2006.
收稿日期：2012-04-06
作者简介：杜 琳（1980-），女，河南洛阳人，讲师，硕士，主要从事植物生物技术研究工作，（电话）13598176716（电子信箱）dulin1980@sohu.com。
