【摘要】目的 观察硫化氢（H2S）对兔心肺复苏后早期NSE、S100B以及海马神经元凋亡的影响。方法 25只日本大耳白兔随机（随机数字法）分为3组：假手术组（S组）、心搏骤停组（CA组）和H2S处理组（H2S组）。兔吸入5%氟烷麻醉后，气管切开，右股静脉置管用于给药，右颈动脉穿刺置管用于血压监测和采血。CA组和H2S组夹闭家兔气管导管8 min制备心搏骤停模型，并分别在恢复自主循环后吸入30% O2或体积分数为80×10—6 H2S。于夹闭气管导管前（基础值）及恢复自主循环后30 min、60 min采动脉血检测血浆中神经元特异性烯醇化酶（neuron—specific enolase， NSE）和S100B的质量浓度。恢复自主循环后60 min处死家兔，取脑后分离海马固定于4%多聚甲醛中，待做组织病理学检查。计量资料以均数±标准差（ x±s ）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用SNK— q 检验，以 P 2S组NSE和S100B的质量浓度均明显增高（ P 2S组恢复自主循环后60 min时S100B质量浓度显著降低（ P 2S抑制海马CA1区神经元凋亡，增加存活神经元数目，降低血浆中S100B的水平，进而减轻心搏骤停复苏后神经功能的损伤。
【关键词】硫化氢；心肺复苏；神经元特异性烯醇化酶；S100B；神经元；凋亡
Effects of hydrogen sulfide on neural function after cardiopulmonary resuscitation in rabbitsTIAN Miao—miao， ZHANG Bing， BAI Li—qun， LI Wen—zhi. Department of Anesthesiology， Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University， Heilongjiang Key Laboratory of Anesthesiology Laboratory of Anesthesiology and Intensive Care Research & Key Laboratory for Basic Theory and Application of Anesthesiology of the Heilongjiang Higher Education Institution， Harbin 150086， China
Corresponding author： LI Wen—zhi ， Email： wenzhili9@126.com
【Abstract】Objective To explore the effects of hydrogen sulfide （H2S） on neuron specific—enolase （NSE），neurotrophic protein S100B and neurons apoptosis in hippocampus CA1 region in the early stage of cardiopulmonary resuscitation （CPR） in rabbits. Methods Twenty—five Japanese white rabbits were randomly divided into three groups： sham group （S group），cardiac arrest group （CA group） and H2S treatment group （H2S group）. Rabbits were anaesthetized with 5% halothane， trachea was exposed and intubated， right femoral vein was cannulated for medical agent administration， and right carotid artery was cannulated for monitoring of blood pressure and blood samples taken. Cardiac arrest was produced by suffocation with clamping the endotracheal tube and turning off mechanical ventilation. After 8 min of the endotracheal tube clamping， rabbits received CPR. After the restoration of spontaneous circulation （ROSC）， rabbits in groups CA and H2S inhaled 30% O2 or 30% O2 containing 80×10—6 H2S， respectively. Blood samples were taken before，and 30 min and 60 min after ROSC for detection of the concentrations of NSE and S100B in the plasma. As 60 min after ROSC， rabbits were decapitated after perfusion with 500 ml phosphate—buffered saline and followed by 4% paraformaldehyde 500 ml through aortic artery， and then the hippocampus was removed rapidly and fixed in 4% paraformaldehyde for the histological examination. All values were expressed in mean± standard deviation （ x± s ）. Comparisons were carried out among different groups with SNK— q test of one—way analysis of variance （One—Way ANOVA plus SNK）. Results In comparison with group S， the concentrations of NSE and S100B were significantly increased 30 min and 60 min after ROSC （ P 2S （ P 2S （ P 2S can inhibit the neurons apoptosis in hippocampus CA1 region， increase the viable neurons， decrease the concentration of S100B in the plasma， and then attenuate the cerebral injury after cardiopulmonary resuscitation in rabbits. 【Key words】Hydrogen sulfide； Cardiopulmonary resuscitation； Neuron—specific enolase； S100B； Neurons； Apoptosis
心搏骤停（cardiac arrest， CA）是临床上常见的紧急事件。近几年来，随着复苏理念、复苏技术和先进设备的应用，使得CA后恢复自主循环（return of spontaneous circulation， ROSC）有所提高，但由于继发神经功能损伤的存在，ROSC后患者的预后仍不是十分理想[1]。有研究表明，H2S能降低多种脏器的缺血—再灌注损伤，并抑制体外培养海马神经元的凋亡[2—3]。但关于外源性H2S气体对CA后神经功能影响的报道较少。本研究采用窒息心搏骤停复苏模型，观察吸入外源性H2S气体对心搏骤停复苏后血浆中神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase， NSE）、S100B以及海马CA1区神经元凋亡的影响，旨在探讨H2S对心肺复苏后神经功能的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物准备
健康成年雄性日本大白兔25只，体质量2.5～3.0 kg，由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。随机（随机数字法）分为3组：假手术组（S组， n =5）、心搏骤停组（CA组， n =10）和H2S处理组（H2S组， n =10）。CA组和H2S组采用窒息法制备CA模型，S组不窒息，其余操作同CA组。CA组于ROSC后即刻吸入30% O2，H2S组吸入含有80×10—6 H2S （大庆雪龙特种气体公司，黑龙江）的30% O2。
家兔术前12 h禁食，不禁水。面罩吸入5%氟烷麻醉后，气管切开置管，耳缘静脉注射哌库溴铵0.1 mg/kg后接小动物呼吸机（Kent Scientific公司，USA）行机械通气，调整呼吸机参数以维持PaCO2于35～45 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），调整氟烷吸入体积分数为0.5%～1.0%以维持麻醉。持续监测心电图和肛温，分离右股静脉并置管用于复苏时给药，右颈总动脉穿刺置管用于血压监测及采血。
1.2 动物模型制备
参照文献[4]的方法制备窒息心搏骤停模型。稳定15 min后，相继吸入纯氧3 min和空气2 min以洗脱氟烷，于呼气末夹闭气管导管并关闭呼吸机制备CA模型。CA标准：心电图示无脉性电活动或一条直线；动脉搏动波消失或平均动脉压（MAP） ≤ 10 mm Hg。窒息8 min后开始复苏，包括机械通气（潮气量15 ml/kg，呼吸频率40次/min，吸入氧体积分数100%），胸外按压（频率180次/min，深度为胸廓前后径1/3）及静脉注射肾上腺素（20 μg/kg）和碳酸氢钠（1 mmol/kg），每3 min重复注射一次，直至心电图显示室上性自主心律及MAP ≥ 50 mm Hg并持续3 min以上。
1.3 实验操作
1.3.1 标本采集与处理 于夹闭气管导管前（基础值）和ROSC后30 min、60 min监测血压和心率，并采集动脉血经离心（3000 r/min，10 min）后分离血浆保存于—80 ℃冰箱待测。ROSC后60 min，以500 ml磷酸盐缓冲盐水（4 ℃）经兔主动脉行全身灌注后，4%多聚甲醛500 ml灌注固定，快速分离海马并固定于4%多聚甲醛中，待石蜡包埋切片做组织病理学检查。
1.3.2 NSE、S100B质量浓度的测定 NSE、S100B质量浓度采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定，检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。检测仪器采用深圳雷拓公司生产的RT—6000酶标仪，试剂盒购自美国GBD公司，标本由专人检测。
1.3.3 存活神经元计数 海马经常规石蜡包埋、切片、HE染色后，光镜（Olympus公司，Japan）下观察海马CA1区神经元，形态正常的神经元可见清晰的细胞核及核仁，缺血的神经元表现为核固缩、核碎裂和核溶解。在同一区域随机选取5个高倍视野（×400）计数存活神经元个数，取平均值为存活神经元的数目。
1.3.4 活化型caspase—3表达的检测 标本经常规石蜡包埋、切片后，行免疫组化染色，染色步骤按说明书进行。一抗为山羊抗兔活化型caspase—3抗体（RB公司，USA，工作效价为1∶50），二抗为辣根酶标记的山羊IgG抗体，DAB显色，苏木素衬染。磷酸盐缓冲盐水代替一抗作为阴性对照。胞浆被染为棕褐色的神经元为活化型caspase—3阳性神经元，即凋亡细胞。在同一区域随机选取5个高倍视野（×400）行凋亡细胞计数，取平均值为凋亡神经元的数目。
1.4 统计学方法
计量资料以均数 ± 标准差（ x±s ）表示，采用SPSS 13.0统计学软件进行单因素方差分析检验，组间比较采用SNK— q 检验，以 P 2和PaCO2的基础值比较无统计学意义（ P > 0.05），CA组和H2S组家兔的窒息时间、心肺复苏时间、肾上腺素用量差异无统计学意义（ P > 0.05）。见表1。
2.2 各组家兔血浆中NSE和S100B质量浓度
与S组比较，CA组和H2S组家兔ROSC后30 min和60 min时NSE和S100B的质量浓度均显著升高（ P 2S组家兔ROSC后60 min时海马CA1区存活神经元数目明显减少（ P 0.05）；与CA组比较，H2S组海马CA1区存活神经元数目增多（ P 2S组神经元肿胀明显消失，细胞形态明显改善，偶见个别神经元固缩。见图1～2。
3 讨论
H2S是近年来发现的继一氧化碳和一氧化氮之后的第三气体信号分子，广泛参与体内的多种生理和病理过程。在脑组织中，H2S的浓度高达50～160 μmol/L，表明它在脑内具有一定的生理功能[5]。Nicholson和 Calvert[6]发现H2S作为一种气体信号分子，可以促进神经细胞和神经胶质细胞生成cAMP而发挥神经调节功能。在大鼠心搏骤停复苏模型中，蔺际䶮等[7]证实ROSC后血浆中H2S浓度显著增高，在6 h达到高峰，认为H2S的变化可能是ROSC后机体代偿性反应的一种体现，但其具体机制仍有待于进一步探讨。
NSE是烯醇化酶的一种同工酶，特异地存在于神经细胞和神经内分泌细胞中，但神经胶质细胞和其他神经组织中不含NSE，因此血浆中升高的NSE可以作为神经元损伤的标志酶[8]。S100B蛋白是一类相对分子质量较小的钙结合蛋白，在脑组织中含量丰富，主要位于中枢神经系统的星形胶质细胞、少突胶质细胞以及周围神经的施旺细胞内，是神经胶质细胞的标记蛋白[9]。心搏骤停复苏后脑组织缺血缺氧，神经细胞和胶质细胞的完整性被破坏，NSE和S100B可从缺血损伤的细胞中“漏出”并透过受损的血脑屏障进入血液循环，因而血浆中NSE和S100B水平升高，且升高的程度和脑损害的严重程度呈正相关[10—12]。马宇洁等[13]的研究表明，心肺复苏后大鼠血浆中NSE和S100B水平明显升高，并分别于ROSC后24 h和6 h达到峰值，以后逐渐回落。在本实验中，家兔心搏骤停复苏后血浆中NSE和S100B质量浓度明显升高，而吸入H2S显著抑制S100B升高的程度，提示了神经细胞和胶质细胞的损伤减少，脑损伤的程度减轻，表明H2S在一定程度上减轻了家兔CA后脑损害。
心搏骤停复苏后，神经元细胞缺血缺氧，大量神经元的凋亡和坏死会引发相应的神经功能障碍，这也是心搏骤停复苏患者预后不理想的主要原因。研究发现caspase—3蛋白参与脑缺血—再灌注损伤后神经元损伤的病理过程，是神经元凋亡中的关键酶，处于凋亡级联反应通路的核心位置，在脑缺血后细胞凋亡中发挥重要作用[14—15]。活化型caspase—3是casepase—3的活化形式。在本实验中，H2S组家兔海马CA1区的活化型caspase—3阳性神经元明显少于CA组，存活的神经元数目也多于CA组，提示吸入H2S能抑制心搏骤停复苏后海马神经元的凋亡。有研究表明，大鼠心肺复苏后，海马CA1区活化型caspase—3阳性神经元数明显增多[16]。Shao等[3]研究发现，体外培养的大鼠海马神经元中，应用150 μmol/L的 NaHS能显著增加大鼠缺氧—再氧合的海马神经元的生存力并抑制其凋亡，从而对缺氧—再氧合的神经元发挥保护作用。
综上所述，心搏骤停复苏后吸入H2S能抑制早期海马神经元的凋亡和增加存活神经元的数目，减少血浆中S100质量浓度的升高，从而发挥神经保护作用，但其具体的机制仍有待于进一步研究。
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（收稿日期：2012—05—24）
（本文编辑：郑辛甜）
DOI：10.3760/cma.j.issn.1671—0282.2012.09.016
基金项目：国家自然科学基金（81000822）； 黑龙江省青年科学基金（QC2010056）
作者单位：150086 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第二医院麻醉科，黑龙江省麻醉与危重病学重点实验室，黑龙江省普通高等学校麻醉基础理论与应用研究重点实验室
通信作者：李文志，Email： wenzhili9@126.com
中华急诊医学杂志2012年9月第21卷第9期Chin J Emerg Med，September 2012，Vol.21，No.9
P987—991
