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    外源基因在大肠杆菌中的诱导表达_木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中的高效表达

    来源:六七范文网 时间:2019-05-22 04:45:28 点击:

      摘要 参照Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A基因序列,以引物拼接方式,人工合成采用大肠杆菌优势密码子的基因xynA,插入pET-20b载体,获得重组表达载体pET-20b-xynA。重组菌在16 ℃下诱导效果最好,10 h酶活达到42.05 U/mL,重组酶占全细胞蛋白的47%,粗酶在65 ℃和pH 5~8条件下很稳定。
      关键词 木聚糖酶A基因;优势密码子;高效表达
      中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2011)12-0326-02
      β-1,4-D-木聚糖水解酶目前已经得到广泛应用,耐热、耐碱、热稳定性好是其理想的特征,其水解产物低聚木糖以木二糖、木三糖为主[1-2]。低聚木糖具有显著的双歧杆菌增殖能力、不被消化等特性,但是自然界木聚糖降解酶系均存在木糖苷酶活性,影响了低聚木糖的产率。因此,构建产木聚糖酶的工程菌,已成为生物技术在食品工业的研究热点。
      疏棉状嗜热丝孢菌是一种嗜热真菌,产生的木聚糖酶在高温和碱性条件稳定,降解产物中单糖含量很少[3]。该酶在原产菌中的表达需要木糖等诱导剂,但是嗜热真菌培养比较困难,产酶周期长且酶系复杂。在原核系统中重组表达的产量很低,不能满足应用要求[4]。该试验尝试采用大肠杆菌中的优势密码子,以引物拼接的方式合成基因,利用pET-20b载体在16 ℃下实现木聚糖酶在大肠杆菌中高效表达。
      1 材料和方法
      1.1 引物设计
      根据Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌DSM 5826木聚糖酶A基因序列,在不改变氨基酸的前提下使用优势密码子,设计14条引物合成基因xynA,相邻引物末端有互补区域以利于引物退火延伸(图1)。
      1.2 引物片断的拼接
      参照美国Promega公司的Altered SitesⅡ Protocol的方法,将14条引物混合磷酸化,产物75 ℃变性后,以大约1 ℃/min的速度缓慢降温至45 ℃退火,再迅速降至22 ℃终止退火。加入DNA聚合酶和连接酶,37 ℃下延伸和补平。
      1.3 目的基因xynA的克隆
      设计上下游引物C1和C2,EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点分别为黑体所示:C1:CCCGAATTCATG CAGACCACCCCGA AC;C2:CCCAAGCTTTTAGCCAACGTCAGCAACAG[2]。以拼接产物为模板,Ex-taq DNA聚合酶巢式PCR扩增基因。反应条件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,循环29次;72 ℃ 10 min。产物回收后双酶切插入质粒pUC19位点。
      1.4 重组表达质粒的构建和表达
      以测序正确的质粒pUC19-xynA为模板,设计合成引物C3和C4(黑体所示分别为NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点):C3:CCCCATATGCAGACCACCCCGAAC;C4:CCCCTCGAGTTA GCCAACGTCAGCA ACAG,以Probest DNA聚合酶进行扩增,条件同1.3。产物回收后双酶切插入质粒pET-20b相应位点。将重组质粒pET-20b-xynA转入大肠杆菌JM109,接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中,37 ℃振荡过夜后转接培养至OD600达0.6,加入IPTG至终浓度0.8 mol/L,分别在37、16 ℃下继续培养12 h,每隔2 h收集菌液。
      1.5 酶活测定
      木聚糖酶活性的测定是以燕麦木聚糖为底物,利用对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)与水解反应产生的还原糖的显色反应进行比色[2,5]。
      2 结果与分析
      2.1 基因的合成及重组表达质粒的构建
      巢氏PCR法扩增出588 bp的片断(图2a),与设计基因序列一致。以pUC19-xynA为模板PCR获得目的基因,构建重组表达质粒pET-20b-xynA,酶切结果与预期一致(图2b)。
      2.2 木聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达
      重组表达质粒转化大肠杆菌JM109,37 ℃诱导2 h酶活达到最大值3.99 U/mL,其后逐渐下降,菌液浓度在诱导4 h时达到最大值;16 ℃诱导10 h酶活性达到最大值42.05 U/mL,菌液浓度缓慢增大,12 h达到最大值(图3)。
      收集诱导10 h时菌液破碎细胞,SDS-PAGE结果表明,重组菌产生约23 kDa的特异条带,与预期蛋白相对分子量一致[2]。16 ℃诱导产生的重组酶在全细胞总蛋白中占比47%,比例比37 ℃诱导时高,但多数重组酶以不溶性的形式存在,复性处理可以重新检测到木聚糖酶活性(图4)。
      2.3 重组木聚糖酶的酶活性质
      粗酶在60 ℃稳定性很高,温育6 h后仍有80%的相对活性,70 ℃下失活很快。在60 ℃下温育30 min,粗酶在pH值5.0~8.0的范围内均比较稳定,相对活性均保持在80%以上,在pH值4.5以下的环境很不稳定[2]。水解木聚糖的产物主要为木二糖、木三糖、木四糖以及其他聚合度的低聚糖[2],没有木糖,说明酶的水解方式没有变化。
      3 讨论
      外源基因在大肠杆菌中表达水平受多因素影响,如启动子、载体、基因的高级结构及密码子偏好等。产自疏棉状嗜热丝孢菌的木聚糖酶A的成熟蛋白共有196个氨基酸,其中31个氨基酸是由大肠杆菌中稀有密码子编码,前10个氨基酸中4个由稀有密码子编码,此外,R58是由最稀有的密码子AGA编码,AGA已经被证明会阻碍蛋白正常表达[2,6];L105和R117分别由CUA和CGA编码,是大肠杆菌中第二稀有密码子对[2]。为避免密码子偏好影响木聚糖酶重组表达,该研究通过基因合成改造木聚糖酶A基因序列。
      该研究实现了重组酶的高水平表达,但多数以包涵体的形式表达,仅有部分有活性。已有多种方法解决蛋白过量表达时出现的包涵体问题,包括共表达分子伴侣、降低表达温度、分泌到胞外培养基或周质空间等[7]。研究发现,16 ℃下酶蛋白表达水平和酶活性均有较大提高,可能是较低温度下酶稳定性更好,仍有多数酶蛋白以包涵体形式存在。研究认为包涵体形成可能是该木聚糖酶自身氨基酸序列的缘故,折叠时不能迅速被大肠杆菌识别,导致翻译的多肽链集聚形成包涵体。有研究报道,氨基酸突变能增加重组蛋白的可溶性[8],后续研究可在这方面进行尝试。   4 参考文献
      [1] 刘超纲,勇强,余世袁.低(无)纤维素酶活的木聚糖酶制备途径与潜在应用[J].纤维素科学与应用,2001,9(2):1-7.
      [2] 殷尔康.疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A在大肠杆菌中的高效表达[D].南京:南京师范大学,2007.
      [3] GOMES J,GOMES I,KREINER W,et al.Production of high level xylanase by a wild strain of Thermomyces lanuginosus using beechwood xylan[J].J Biotechnol,1993,30(3):283-297.
      [4] SCHLACHER A,HOLZMANN K,HAYN M,et al.Cloning and characte-rization of the gene for the thermostable xylanase XynA from Thermom-yces lanuginosus[J].J Biotechnol,1996,49(1-3):211-218.
      [5] LEVER M.A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates[J].Anal Biochem,1972,47(1):273-279.
      [6] HU X,SHI Q,YANG T,et al. Specific replacement of consecutive AGG codons results in high-level expression of human cardiac troponin T in Escherichia coli[J].Protein Exp Purif,1996,7(3):289-293.
      [7] CHOI J H,LEE S Y.Secretory and extracellular production of recombin-ant proteins using Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2004,64(5):625-635.
      [8] DALE G E,BROGER C,LANGEN H,et al.Improving protein solubility through rationally designed amino acid replacements:solubilization of the trimethoprim-resistant type S1 dihydrofolate reductase[J].Protein Eng,1994,7(7):933-939.