摘要 参照Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A基因序列，以引物拼接方式，人工合成采用大肠杆菌优势密码子的基因xynA，插入pET-20b载体，获得重组表达载体pET-20b-xynA。重组菌在16 ℃下诱导效果最好，10 h酶活达到42.05 U/mL，重组酶占全细胞蛋白的47%，粗酶在65 ℃和pH 5～8条件下很稳定。
关键词 木聚糖酶A基因；优势密码子；高效表达
中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）12-0326-02
β-1，4-D-木聚糖水解酶目前已经得到广泛应用，耐热、耐碱、热稳定性好是其理想的特征，其水解产物低聚木糖以木二糖、木三糖为主[1-2]。低聚木糖具有显著的双歧杆菌增殖能力、不被消化等特性，但是自然界木聚糖降解酶系均存在木糖苷酶活性，影响了低聚木糖的产率。因此，构建产木聚糖酶的工程菌，已成为生物技术在食品工业的研究热点。
疏棉状嗜热丝孢菌是一种嗜热真菌，产生的木聚糖酶在高温和碱性条件稳定，降解产物中单糖含量很少[3]。该酶在原产菌中的表达需要木糖等诱导剂，但是嗜热真菌培养比较困难，产酶周期长且酶系复杂。在原核系统中重组表达的产量很低，不能满足应用要求[4]。该试验尝试采用大肠杆菌中的优势密码子，以引物拼接的方式合成基因，利用pET-20b载体在16 ℃下实现木聚糖酶在大肠杆菌中高效表达。
1 材料和方法
1.1 引物设计
根据Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌DSM 5826木聚糖酶A基因序列，在不改变氨基酸的前提下使用优势密码子，设计14条引物合成基因xynA，相邻引物末端有互补区域以利于引物退火延伸（图1）。
1.2 引物片断的拼接
参照美国Promega公司的Altered SitesⅡ Protocol的方法，将14条引物混合磷酸化，产物75 ℃变性后，以大约1 ℃/min的速度缓慢降温至45 ℃退火，再迅速降至22 ℃终止退火。加入DNA聚合酶和连接酶，37 ℃下延伸和补平。
1.3 目的基因xynA的克隆
设计上下游引物C1和C2，EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点分别为黑体所示：C1：CCCGAATTCATG CAGACCACCCCGA AC；C2：CCCAAGCTTTTAGCCAACGTCAGCAACAG[2]。以拼接产物为模板，Ex-taq DNA聚合酶巢式PCR扩增基因。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循环29次；72 ℃ 10 min。产物回收后双酶切插入质粒pUC19位点。
1.4 重组表达质粒的构建和表达
以测序正确的质粒pUC19-xynA为模板，设计合成引物C3和C4（黑体所示分别为NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点）：C3：CCCCATATGCAGACCACCCCGAAC；C4：CCCCTCGAGTTA GCCAACGTCAGCA ACAG，以Probest DNA聚合酶进行扩增，条件同1.3。产物回收后双酶切插入质粒pET-20b相应位点。将重组质粒pET-20b-xynA转入大肠杆菌JM109，接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，37 ℃振荡过夜后转接培养至OD600达0.6，加入IPTG至终浓度0.8 mol/L，分别在37、16 ℃下继续培养12 h，每隔2 h收集菌液。
1.5 酶活测定
木聚糖酶活性的测定是以燕麦木聚糖为底物，利用对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）与水解反应产生的还原糖的显色反应进行比色[2，5]。
2 结果与分析
2.1 基因的合成及重组表达质粒的构建
巢氏PCR法扩增出588 bp的片断（图2a），与设计基因序列一致。以pUC19-xynA为模板PCR获得目的基因，构建重组表达质粒pET-20b-xynA，酶切结果与预期一致（图2b）。
2.2 木聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达
重组表达质粒转化大肠杆菌JM109，37 ℃诱导2 h酶活达到最大值3.99 U/mL，其后逐渐下降，菌液浓度在诱导4 h时达到最大值；16 ℃诱导10 h酶活性达到最大值42.05 U/mL，菌液浓度缓慢增大，12 h达到最大值（图3）。
收集诱导10 h时菌液破碎细胞，SDS-PAGE结果表明，重组菌产生约23 kDa的特异条带，与预期蛋白相对分子量一致[2]。16 ℃诱导产生的重组酶在全细胞总蛋白中占比47%，比例比37 ℃诱导时高，但多数重组酶以不溶性的形式存在，复性处理可以重新检测到木聚糖酶活性（图4）。
2.3 重组木聚糖酶的酶活性质
粗酶在60 ℃稳定性很高，温育6 h后仍有80%的相对活性，70 ℃下失活很快。在60 ℃下温育30 min，粗酶在pH值5.0～8.0的范围内均比较稳定，相对活性均保持在80%以上，在pH值4.5以下的环境很不稳定[2]。水解木聚糖的产物主要为木二糖、木三糖、木四糖以及其他聚合度的低聚糖[2]，没有木糖，说明酶的水解方式没有变化。
3 讨论
外源基因在大肠杆菌中表达水平受多因素影响，如启动子、载体、基因的高级结构及密码子偏好等。产自疏棉状嗜热丝孢菌的木聚糖酶A的成熟蛋白共有196个氨基酸，其中31个氨基酸是由大肠杆菌中稀有密码子编码，前10个氨基酸中4个由稀有密码子编码，此外，R58是由最稀有的密码子AGA编码，AGA已经被证明会阻碍蛋白正常表达[2，6]；L105和R117分别由CUA和CGA编码，是大肠杆菌中第二稀有密码子对[2]。为避免密码子偏好影响木聚糖酶重组表达，该研究通过基因合成改造木聚糖酶A基因序列。
该研究实现了重组酶的高水平表达，但多数以包涵体的形式表达，仅有部分有活性。已有多种方法解决蛋白过量表达时出现的包涵体问题，包括共表达分子伴侣、降低表达温度、分泌到胞外培养基或周质空间等[7]。研究发现，16 ℃下酶蛋白表达水平和酶活性均有较大提高，可能是较低温度下酶稳定性更好，仍有多数酶蛋白以包涵体形式存在。研究认为包涵体形成可能是该木聚糖酶自身氨基酸序列的缘故，折叠时不能迅速被大肠杆菌识别，导致翻译的多肽链集聚形成包涵体。有研究报道，氨基酸突变能增加重组蛋白的可溶性[8]，后续研究可在这方面进行尝试。 4 参考文献
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